不同條件對產黃青霉菌原生質體制備率與再生率的影響

摘 要：本文研究了不同菌齡、預處理時間、酶解時間、酶濃度等對產黃青霉菌原生質體制備率與再生率的影響，確定了有利制備率與再生率提高的最佳條件。

關鍵詞：產黃青霉菌 原生質體制備 原生質體再生

中圖分類號：R965 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）04（a）-0123-01

原生質體融合能將遺傳特性不同的兩親本原生質體融合雜交，篩選后獲得集雙親優良性狀于一體的穩定融合子[1]。當前使用最廣泛的就是以PEG為融合劑的化學法，具有經濟、方便、可重復性強等優點[2]。產黃青霉菌是原生質體融合的常用菌種，原生質體制備是融合的前提。本文探討了在菌齡、預處理時間、酶解時間、酶濃度等不同水平下，同時有利于制備率與再生率提高的綜合條件，為提高產黃青霉菌與其他菌的融合提供了實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產黃青霉菌

1.1.2 試劑

（1）緩沖液（CPB）：0.2 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖溶液中。按文獻[4]配制。

（2）高滲緩沖液：以CPB配制的0.8 mol /L山梨醇。

（3）酶液：以CPB配制。（4）預處理劑：0.05 mol/L EDTA-Na2溶液+0.2%β-巰基乙醇，以CPB配制。

1.1.3 培養基

（1）液體完全培養基（YEPD）：參照文獻[3]。（2）再生培養基（YEPDS）：參照文獻[3]。

以上均以0.73×105Pa滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 原生質體制備

參照文獻[4]。

1.2.2 原生質體再生

參照文獻[4]。

1.2.3 影響原生質體制備率與再生率的單因素試驗

（1）菌齡：14 h，16 h，18 h，20 h。（2）預處理時間：10 min，20 min，30 min。

（3）酶解時間：15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min。（4）酶濃度：0.5%，1.0%，2.0%，4.0%。

2 結果與分析

2.1 不同處理條件對產黃青霉菌原生質體制備率與再生率的影響

2.1.1 菌齡對制備率與再生率的影響 本試驗研究了同時接種后培養12 h、14 h、16、18 h菌齡的菌體相對應的制備率依次為94.8%、91.1%、83.4%、71.7%，再生率依次為2.5%、3.0%、3.3%、3.9%。試驗結果可見，再生率隨著菌齡延長，產黃青霉原生質體的制備率逐漸降低，而再生率則逐漸升高。

2.1.2 預處理時間對制備率與再生率的影響

預處理時間10 min、20 min、30 min對應的制備率依次為80.3%、88.1%、91.9%，再生率依次為4.2%、3.6%、1.9%。試驗結果可見，預處理對原生質體的制備有促進作用，制備率隨預處理時間延長而升高；但是對細胞壁的再生起副作用，再生率隨時間延長而下降。

2.1.3 酶解時間對制備率與再生率的影響

酶解時間15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min對應的制備率依次為55.1%、85.1%、89.3%、91.0%、93.2%、95.2%，再生率依次為4.2%、3.3%、2.3%、1.1%、0.9%、0.6%，試驗結果可見在120 min內，原生質體形成率與酶作用時間成正比遞增，120 min左右細胞基本原生質體化，但是再生率在15 min時最高，隨時間延長而降低。

2.1.4 酶濃度對制備率與再生率的影響

對0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的酶濃度對制備率與再生率進行試驗，對應的制備率依次為63.25%、73.58%、88.57%、90.68%，再生率為4.15%、3.55%、3.23%、1.60%。結果可見，隨著酶濃度的增加原生質體的制備率升高，再生率降低。

2.2 優化條件下的產黃青霉原生質體制備率與再生率

綜合以上試驗結果可以得出如下結論：菌齡16 h，以2.0%蝸牛酶進行酶解，酶解溫度30℃，酶解時間30 min，0.8 mol/L山梨醇做滲透壓穩定劑，以0.05 mol/L EDTA-Na2溶液和0.2%β-巰基乙醇為預處理劑處理20min為產黃青霉原生質體制備率和再生率均較高的最佳條件。在此優化條件下，原生質體形成率為85.1%，再生率為3.8%。

3 討論

3.1 制備率

菌體的原生質體制備主要是細胞的去壁，菌齡與細胞壁密切相關。對數生長期的菌體細胞壁較薄，對酶更加敏感；穩定期細胞壁厚，不利于酶解，制備率反而會隨菌齡的延長而降低。

去除細胞壁是對菌體的一種破壞，破壞時間越長原生質體生成量越多。EDTA-Na2能產破壞黃青霉菌細胞壁外層，也利于蝸牛酶滲入內層促進細胞壁的降解和避免影響酶活；β-巰基乙醇可破環細胞壁碳骨架中的二硫鍵，促進擴散進入內壁層，因而預處理時間越長原生質體制備率越高。因此，在本試驗所選擇的酶解時間和酶濃度范圍內原生質體的制備率與二者呈正相關。

3.2 再生率

菌體的菌齡越長，細胞壁強度越高，失去細胞壁后更利于壁的再生，所以隨著菌齡的延長再生率也升高。

菌體被破壞的越嚴重其細胞壁的再生也就越困難。β-巰基乙醇對細胞本身也具有毒性，所以預處理時間越長原生質體再生率也就越低。由于蝸牛酶是混合酶，混有蛋白酶和核酸酶等對原生質體有損傷作用的酶類，故不宜長時間或高濃度的將原生質體暴露其中。目前已有文獻表明，在膜外有殘余細胞壁組分時會更有利于壁的再生。因此，選擇合適的酶濃度及酶解時間以減少對菌體的破壞而有利于對原生質體的再生是有利的。

參考文獻

[1] 羅立，潘力，鄭穗平.細胞工程[M].廣州：華南理工大學出版社，2003：5-19.

[2] 王娟娟，賈彥軍.微生物原生質體融合方法的綜述[J].畜牧獸醫科技信息，2005，10：17-19.

[3] 文鐵橋，趙學慧.克魯維酵母與釀酒酵母屬間原生質體融合構建高溫酵母菌株[J].菌物系統，1999，18（1）：89-93.

[4] 龔建根，劉頤屏.產黃青霉菌和頂頭孢霉菌原生質體形成、再生和屬間融合[J].中國醫藥工業雜志，1991（5）.