脫細胞角膜基質制備方法研究進展

摘 要：脫細胞角膜基質作為組織工程角膜的研究新熱點，不僅保持了天然角膜的結構特征和力學性能，且含有人工合成支架所不具備的細胞生長因子等，為種子細胞生長提供了理想的環境，同時也去除了組織中可能引發免疫排斥反應的細胞成分。本文對最近幾年異種脫細胞角膜基質的制備方法進行綜述，并指出了各種方法的優缺點。

關鍵詞：脫細胞角膜基質 組織工程 制備方法

中圖分類號：R32 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）04（a）-0226-01

異種脫細胞角膜基質作為組織工程角膜的支架具有免疫原性低、含多種細胞因子、機械強度好、可塑性好等優點。近年來，實驗過程中采用兔、牛、犬、豬等多種動物作為角膜供體，并獲得了不同程度的移植效果。理想的脫細胞方法的目的是完全去除組織中的細胞成分及核物質，從而減少移植受者免疫反應，同時保持細胞外基質（ECM）的結構和功能蛋白，維持角膜的透明度，并且能夠支持角膜細胞生長。現就脫細胞角膜基質的制備方法及各方法的優缺點進行綜述。

1 物理制備方法

1.1 反復凍融法

反復凍融法是利用低溫下細胞內部會產生冰晶，剩余的細胞液由于鹽濃度增高而引起溶脹，再室溫融解，反復多次即可使細胞結構破碎，從而使細胞內物質釋放出來。單純使用該方法，脫細胞效果并不理想，因此常聯合其它脫細胞方法。

1.2 高靜壓技術

高靜壓技術（HHP）的主要機理是使組織中細胞的細胞膜損傷，并影響細胞內酶活力及細胞內營養物質和廢棄物的運輸，從而使細胞裂解。利用高靜壓技術對豬角膜進行脫細胞處理，能夠有效去除細胞，并且保持了膠原纖維的排列結構，同時減少糖胺聚糖（GAG）的損失。此外，HHP技術在處理過程中不添加去污劑，沒有細胞毒性，脫細胞的同時去除了角膜中的細菌和病毒。然而這項技術需要昂貴的專業設備，制備成本高，因而限制了其引用和發展。

2 化學制備方法

2.1 去污劑處理法

離子型去污劑能夠破壞蛋白與蛋白之間的連接結構，從而使得蛋白質發生變性作用。最常用的離子型去污劑是十二烷基磺酸鈉（SDS），其作為生物膜的溶解劑，能夠有效去除組織中的細胞成分。Du等[1]研究表明0.5%～1%SDS能夠有效去除細胞，且不破壞ECM的天然組織結構。然而，SDS處理會降低GAG的總含量，損傷基底膜，并且造成膠原結構松散。

非離子型去污劑不破壞蛋白與蛋白之間的連接，而只是破壞脂質與脂質之間和脂質與蛋白之間的結構，且作用溫和，已被廣泛應用于脫細胞研究中。其中最常用的非離子型去污劑是TritonX-100。陳蘋等[2]研究發現1%TritonX-100能夠有效去除角膜基質中的細胞成分，并且能夠維持膠原纖維結構。但也有研究報道濃度為5%的TritonX-100對角膜的脫細胞效果不佳[1]。

兩性離子型去污劑能夠增溶膜蛋白并破壞蛋白-蛋白之間的相互作用，具有離子型及非離子型去污劑的雙重特性。其中最常用的兩性離子去污劑為CHAPS。但Du等[1]利用該去污劑處理豬角膜，發現去除角膜細胞的效果較差，角膜基質中常會殘留細胞碎片。

2.2 酸、堿處理法

酸、堿通常與去污劑和醇類結合使用，能夠引起或是促進生物分子的水解。Ponce Márquez等[3]使用過氧乙酸聯合乙醇對牛角膜進行脫細胞處理，但是脫細胞效果并不理想，組織邊緣仍有細胞殘留，說明該方法仍有待改進。

2.3 高滲溶液、低滲溶液處理法

利用高滲和低滲溶液能夠使細胞內的滲透壓發生變化，如使用去離子水、低離子強度的溶液導致組織的細胞松解和細胞膜的破裂，從而達到脫細胞的目的。該方法操作簡便，對組織的形態結構破壞不明顯，但是脫細胞效果不佳，且所需時間較長，故很少單獨應用。

3 酶消化法

酶消化法主要用于對去污劑未去除干凈的細胞成分進行進一步清除，主要包括蛋白酶和核酸酶。最常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶和中性蛋白酶。胰蛋白酶能夠溶解變性的蛋白質，從而破壞細胞的結構。在多項研究中，胰蛋白酶被用于分散角膜的ECM結構，以利于之后的脫細胞試劑滲透進入角膜內部。此外，磷脂酶A2能夠水解細胞的磷脂成分，因而也被應用于脫細胞處理，并取得了良好的脫細胞效果，但是角膜處理后GAG含量會顯著降低。

4 血清處理法

血清中含有核酸酶，能夠降解DNA和RNA。Shao等[4]首先提出單純用人血清對豬角膜進行脫細胞處理。之后，其改進了方法，將人血清處理與電泳法相結合。先將豬角膜在無菌的100%人血清中孵育1天，之后對角膜進行電泳。該方法能夠完全去除細胞，并且保持了角膜的透明度。

5 結語

脫細胞角膜基質是構建組織工程角膜理想的生物材料，具有優良的生物相容性和組織相容性。要獲得比較理想的脫細胞效果，同時最大程度地保留原有組織結構，通常需要多種脫細胞方法聯合應用。建議應用最溫和的方法進行處理，從而將脫細胞過程對ECM的結構、功能產生的影響降低到最小程度。一般先在高滲或低滲溶液浸泡，隨后用去污劑處理，從而獲得理想的脫細胞角膜基質。

參考文獻

[1]Du L，Wu X.Development and characterization of a full-thickness acellular porcine cornea matrix for tissue engineering[J].Artif Organs，2011，35（7）：691-705.

[2]陳蘋，傅瑤，范先群.豬角膜脫細胞基質的制備及生物相容性的實驗研究[J]. 眼科研究，2006，24（4）：367-370.

[3]Ponce Márquez S，Martínez VS，McIntosh Ambrose W，et al. Decellularization of bovine corneas for tissue engineering applications[J].Acta Biomater.2009，5：1839-1847.

[4]Shao Y，Quyang L，Zhou Y，et al.Preparation and physical properties of a novel biocompatible porcine corneal acellularized matrix[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2010，46（7）：600-605.