丹參酮ⅡA對腹膜透析液誘導的氧化應激及腹膜間皮細胞凋亡因子表達的影響

夏陽陽，蔣春明，孫琤，于立杰，張苗

(1.南京醫科大學鼓樓臨床醫學院，江蘇南京 210008;2.南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院腎內科，江蘇南京 210008)

目前臨床廣泛使用的葡萄糖腹膜透析液(PDF)具有明顯的非生物相容性，長期使用可導致腹膜損傷，進而導致腹膜纖維化。腹膜間皮細胞發生凋亡是腹膜纖維化發生發展重要機制之一。目前研究表明，葡萄糖PDF可通過誘導氧化應激反應而促進細胞發生凋亡［1-2］。以往研究證實，丹參酮ⅡA(TSN)在體內、外具有顯著抑制多種細胞氧化應激和凋亡的作用［3-4］。本研究主要通過體外細胞培養干預，旨在了解TSN能否通過抑制PDF誘導的氧化應激下調人腹膜間皮細胞(HPMCs)凋亡因子的表達。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

正常澳洲胎牛血清、High-glucose DEME培養基、0.25%EDTA-Trypsin均購自GIBCO公司(Great Island，紐約，美國);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Trizol以及引物購自invitrogen公司(Carlsbad，加利福尼亞洲，美國)，逆轉錄及Real-time-PCR反應試劑盒為日本TAKARA公司(大連，中國)產品;兔抗人 bcl-2、bax抗體購自 Cell Signaling公司(Boston，波士頓，美國)，鼠抗人caspase-3抗體購自碧云天生物技術研究所(海門，中國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IGg抗體購自Cell Signaling公司(Boston，波士頓，美國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IGg抗體購自碧云天生物技術研究所(海門，中國);4.25%PDF為廣州百特醫療用品公司(廣州，中國)產品，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液為江蘇科菲平醫藥有限公司(南京，中國)產品，30%過氧化氫為南京寧試化學試劑有限公司(南京，中國)產品。

1.2 HPMCs的培養與鑒定

取3位擇期腹部手術(非尿毒癥、糖尿病、腫瘤、腹膜炎)患者的大網膜組織，按文獻［5］方法原代培養HPMCs，按1∶3傳代，第3代用于實驗，傳代細胞經倒置相差顯微鏡觀察，免疫組化鑒定抗細胞角蛋白抗體陽性、抗波形蛋白染色陽性、抗Ⅷ因子抗體陰性、抗白細胞CD45抗體染色陰性。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與分組 氧化應激指標檢測分組:用含10%胎牛血清的High-glucose DMEM培養液培養HPMCs，放置于含體積分數為5%的CO2培養箱37℃培養。同步培養24 h后分為5組:對照組(DEME培養基)、PDF組(4.25%PDF)、TSN組(含TSN終濃度為100μmol·L-1的 DEME培養基)、TSN低濃度組(含TSN 終濃度為50 μmol·L-1的4.25%PDF)、TSN高濃度組(含TSN終濃度為100μmol·L-1的4.25%PDF)，在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中繼續培養48 h用于實驗，實驗重復3次。細胞凋亡因子檢測分組:按照上述培養方法同步培養后分為5組:對照組(DEME 培養基)、H2O2組(3%H2O2)、TSN+H2O2組(含TSN終濃度為50μmol·L-1的3%H2O2)、PDF組(4.25%PDF)、TSN+PDF組(含TSN 終濃度為50μmol·L-1的4.25%PDF)，在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中繼續培養72 h用于實驗，實驗重復3次。

1.3.2 上清液中MAD、SOD、GSH濃度檢測 取各組細胞培養的上清液，將其保存于-20℃冰箱。按照試劑盒說明分別用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝酸苯甲酸顯色法檢測上清液MDA、SOD、GSH濃度。

1.3.3 Real time PCR 法檢測 bax、caspase-3、bcl-2 基因的表達 用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，1μg RNA按照逆轉錄試劑盒(TAKARA公司)說明逆轉錄為 cDNA，20 μl的 bax、caspase-3、bcl-2 反應體系用于PCR擴增。反應在7500Real-time-PCR儀上進行，反應條件:95℃ 30 s，預變性，1個循環;95℃ 5 s，65℃ 34 s，PCR反應，共40個循環。使用GAPDH作為內參，通過2—ΔΔCT方法計算基因表達的相對比值。Real time PCR引物序列見表1。

1.3.4 Western Blot法檢測 bax、caspase-3、bcl-2 蛋白表達 用RIPA細胞裂解液提取總蛋白，按BCA試劑盒(凱基生物公司)說明采用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，放入5%脫脂牛奶在搖床上緩慢搖動，進行室溫封閉60 min。然后加入兔抗人抗體bcl-2、bax(1∶1 000 稀釋)、鼠抗人抗體 caspase-3(1∶500稀釋)和 GAPDH(1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜，每次10 min，共4次，然后加入相對應的HRP標記羊抗兔IGg抗體和HRP標記羊抗鼠IGg抗體，室溫孵育2 h。再次用同樣方法洗膜后加入ECL顯色液進行顯色，曝光。使用Quantity one分析軟件對目的條帶進行灰度值分析，目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值為所測蛋白的相對含量。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

1.4 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計分析。數據用均數±標準差表示，組間數據比較采用方差分析;兩組間比較采用LSD法檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 上清液中氧化應激指標MAD、SOD、GSH濃度檢測結果

各組上清中 MDA、SOD、GSH的含量見表2。其中，PDF組 MDA的含量較對照組顯著升高(P＜0.01)，SOD、GSH的含量顯著降低(P＜0.01)。與PDF組比較，加入不同濃度TSN的PDF組的MDA含量都明顯降低(P＜0.01)，SOD、GSH的含量都顯著升高(P＜0.01)，但未發現與 TSN濃度高低(50、100μmol·L-1)存在劑量依賴關系(P＞0.05)。

表2 上清液中MDA、SOD、GSH的水平Tab 2 The levels of MAD，SOD，GSH in the supernatant

2.2 Real time PCR結果

與對照組比較，H2O2組和PDF組的bax、caspase-3的 mRNA表達量顯著增加(P＜0.01)，bcl-2的mRNA表達量顯著減少(P＜0.01)。與H2O2組比較，TSN+H2O2組 bax、caspase-3的 mRNA表達量減少(P＜0.01)，bcl-2的mRNA表達量增加(P＜0.01)。與PDF組比較，TSN+PDF組bax、caspase-3的mRNA表達量減少(P＜0.01)，bcl-2的mRNA表達量增加(P＜0.01)。bax、caspase-3、bcl-2的 mRNA 表達情況及定量分析結果見圖1。

圖1 bax、caspase-3、bcl-2 mRNA Real time PCR 分析結果Fig 1 Real-time quantitative analysis of bax，caspase-3，bcl-2 mRNA

2.3 Western Bolt結果

與對照組比較，H2O2組和PDF組bax、caspase-3的蛋白表達量顯著增加(P＜0.01)，bcl-2的蛋白表達量顯著減少(P＜0.01)。與H2O2組比較，TSN+H2O2組bax、caspase-3的蛋白表達量減少(P＜0.01)，bcl-2的蛋白表達量增加(P＜0.01)。與PDF組比較，TSN+PDF組bax、caspase-3的蛋白表達量減少(P＜0.01)，bcl-2的蛋白表達量增加(P＜0.01)。bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達情況及定量分析結果見圖2～4。

圖2 bax蛋白印跡分析結果Fig 2 Western Blot analysis of bax

圖3 caspase-3蛋白印跡分析結果Fig 3 Western Blot analysis of caspase-3

3 討 論

圖4 bcl-2蛋白印跡分析結果Fig 4 Western Blot analysis of bcl-2

長期使用非生物相容PDF可以導致腹膜纖維化。目前研究表明，腹膜纖維化的發生與PDF所導致的HPMCs凋亡密切相關。凋亡因子表達上調可以啟動細胞凋亡的發生。既往已有研究表明PDF可以誘導腹腔發生氧化應激［6］，是上調凋亡因子表達的重要因素之一。Kapoor等［7］研究表明，使用抗氧化劑可以抑制高糖誘導的小鼠肝細胞氧化應激并下調凋亡因子的表達。TSN是一種新型有效的抗氧化劑，已被證實具有明顯的抗氧化、清除自由基和保護細胞功能等作用［8-9］。作者旨在研究TSN是否具有抑制PDF誘導的HPMCs氧化應激并下調細胞凋亡因子表達的作用。

以往的研究表明，非生物相容性透析液導致的腹膜損傷與腹腔高氧化應激狀態有關［10］。Diaz-Buxo等［11］通過對動物模型的研究表明，使用非生物相容性的PDF 30 d后大鼠腹腔內氧化應激指標顯著升高，腹膜硬化明顯，且腹膜超濾功能顯著降低，提示氧化應激在腹膜損傷中起重要作用。本研究發現，在含有高糖PDF的刺激下，培養細胞HPMCs的上清液中氧化應激指標MDA濃度顯著高于對照組，SOD、GSH濃度顯著低于對照組，表明高糖PDF可以誘導HPMCs氧化應激發生。在添加TSN后氧化應激指標MDA濃度顯著降低，SOD、GSH濃度顯著升高，提示TSN在體外的確具有抑制PDF誘導HPMCs氧化應激作用。

細胞發生凋亡是氧化應激損傷的重要后果之一，氧化應激產生的氧自由基可以使生物膜的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，改變細胞膜的結構及通透性以及線粒體損傷，從而使凋亡因子bax、caspase-3釋放到細胞漿內，導致細胞發生凋亡［12-13］。以往研究證實，生物非相容PDF可以導致腹膜間皮細胞凋亡。Boulanger等［14］通過使用不同濃度葡萄糖的透析液與HPMCs共培養發現，HPMCs的凋亡率與透析液葡萄糖濃度成正比。本研究亦發現加入高糖PDF后，HPMCs的凋亡因子mRNA及蛋白含量顯著高于對照組，抑制凋亡因子mRNA及蛋白的含量顯著低于對照組，證實高糖PDF可以誘導腹膜間皮細胞凋亡。在添加TSN后，HPMCs的凋亡因子mRNA及蛋白含量顯著低于PDF組，抑制凋亡因子mRNA及蛋白的含量顯著高于PDF組，表明TNN具有抑制PDF誘導的腹膜間皮細胞凋亡作用。

本實驗中設立了H2O2組和TSN+H2O2組，以進一步探討TSN抑制細胞凋亡的作用是否與其抑制氧化應激損傷有關。我們的研究發現H2O2組較對照組細胞凋亡因子bax、caspase-3表達增多，抑制凋亡因子bcl-2表達降低，提示氧化應激的確可以誘導腹膜間皮細胞凋亡。加入TSN后，和H2O2組相比，細胞凋亡因子bax、caspase-3表達顯著減少，抑制凋亡因子bcl-2表達顯著增多，表明丹參酮可以有效抑制氧化應激誘導的腹膜間皮細胞凋亡。因此，丹參酮對腹膜間皮細胞的保護作用可能是通過抑制氧化應激反應和抑制氧化應激導致的細胞損傷兩方面實現的。

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