hsa-miR-21的生物信息學(xué)特征分析

黃海進(jìn)，徐廣峰，焦峰

(中國(guó)人民解放軍第82醫(yī)院，江蘇 淮安 223001)

MicroRNAs(miRNAs)是一類具有在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼小分子 RNAs。據(jù)推測(cè)［1］，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因，參與機(jī)體諸多生理病理過(guò)程。Hsa-miR-21作為一個(gè)致癌miRNA，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。近年來(lái)，hsa-miR-21在消化道腫瘤發(fā)病過(guò)程中的作用也受到關(guān)注［2-4］，但其具體調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能還不完全清楚。作者對(duì)hsa-miR-21已有文獻(xiàn)做了分析總結(jié)，并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)其潛在靶標(biāo)進(jìn)行了功能富集分析(GO analysis)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(pathway analysis)，旨在為對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行功能研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 方 法

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測(cè)

AGS、QBC939、ECA109和 Het-1A細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，細(xì)胞總RNA抽提試劑 Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miRNA分離試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及hsa-miR-21和U6探針購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。realtime qPCR在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行。采用2-△△CT法計(jì)算hsa-miR-21相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以±s表示。采用SPSS16.0軟件，多組均數(shù)間的比較采用方差分析F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源網(wǎng)站

通過(guò)pubmed綜述文獻(xiàn)支持的hsa-miR-21已有功能;選擇miRbase和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析hsa-miR-21序列保守性和所在基因組特征;選擇TargetScan、PicTar、miRanda 3種方法預(yù)測(cè)hsa-miR-21的靶基因，取3者預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，并結(jié)合已證實(shí)的靶標(biāo)基因作為進(jìn)一步分析的基因集合。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將hsa-miR-21的靶基因集合用GeneOntology進(jìn)行功能富集分類，功能富集分析用到fisher精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，分別得到P值和P(k)值，通過(guò)多重比較檢驗(yàn)，確定功能富集的誤判率(false discovery rate，F(xiàn)DR)，結(jié)果用q值(用來(lái)判斷P值的準(zhǔn)確性)表示，最后得出顯著性功能富集，完成功能富集分析。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析是對(duì)基因參與的所有信號(hào)通路進(jìn)行顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析，用到的分析方法同功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 AGS、QBC939、ECA109及其 Het-1A 細(xì)胞株中hsa-miR-21表達(dá)水平

實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)的結(jié)果提示:AGS、QBC939細(xì)胞株中hsa-miR-21表達(dá)水平顯著上調(diào)，明顯高于Het-1A細(xì)胞(圖1)。

圖1 hsa-miR-21在 AGS、QBC939、Het-1A 和 ECA109細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量Fig 1 Relative expression level of hsa-miR-21 in AGS，QBC939，Het-1A and ECA109 cell line

2.2 hsa-miR-21已有功能分析

通過(guò)pubmed檢索的文獻(xiàn)可見(jiàn)，hsa-miR-21參與多種腫瘤、肥胖以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制(表1)［5-14］。

2.3 miR-21的同源性鑒定

hsa-miR-21定位于人17q23.1，由miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的miR-21序列信息可見(jiàn)，在包括人、小鼠、褐鼠、恒河猴、黑猩猩、大猩猩、婆羅州猩猩、豚尾獼猴、蜘蛛猴、侏儒黑猩猩、歐洲牛、雞、短尾負(fù)鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、鴨嘴獸、狗、普氏野馬、珍珠鳥(niǎo)、安樂(lè)蜥以及野豬在內(nèi)的20個(gè)物種間miR-21的“UAGCUUAUCAGACUGA UGUUGA”22個(gè)堿基序列具有高度的保守性。

表1 文獻(xiàn)支持的hsa-miR-21直接相關(guān)靶標(biāo)Tab 1 Direct related target of hsa-miR-21 supported by literature

2.4 hsa-miR-21的候選靶基因

Targetscan、PicTar及MiRanda預(yù)測(cè)的 hsa-miR-21靶基因數(shù)量分別為210、175、5 203個(gè)，3種預(yù)測(cè)方法結(jié)果的交集并結(jié)合已證實(shí)的10個(gè)靶標(biāo)共獲得32個(gè)候選靶基因(表2)。

表2 hsa-miR-21候選靶基因Tab 2 Candidate target genes of hsa-miR-21

2.5 hsa-miR-21候選靶基因集合的功能富集分析結(jié)果

功能富集分析預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，hsa-miR-21調(diào)控的靶基因功能分別富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Notch信號(hào)通路的正向調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程(圖2)。

2.6 hsa-miR-21候選靶基因集合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析的結(jié)果顯示，hsa-miR-21靶基因顯著富集于Notch信號(hào)通路、細(xì)胞周期和軸突導(dǎo)向等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖3)。

3 討 論

近年來(lái)，miRNA的功能引人關(guān)注。已證實(shí)miRNA是真核生物體內(nèi)一類對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA，調(diào)控著人類近三分之一基因的功能，幾乎參與一切重要生命活動(dòng)和大多數(shù)疾病的發(fā)病過(guò)程［1］。國(guó)內(nèi)有多篇優(yōu)秀文章對(duì)miRNA與腫瘤的關(guān)系做了總結(jié)［15-16］。最近，hsa-miR-21在腫瘤發(fā)病過(guò)程中的生物學(xué)作用也受到關(guān)注［17］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hsamiR-21在胃癌細(xì)胞株以及膽管癌細(xì)胞株中呈顯著高表達(dá)，提示該miRNA可能參與消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

miRNA通過(guò)與靶基因的3'非編碼區(qū)結(jié)合，從而起到降解或抑制靶mRNA翻譯的作用。目前，一些hsamiR-21的直接靶基因及部分功能已經(jīng)得到了鑒定，從表1中我們可以看到hsa-miR-21通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的靶基因參與腫瘤的形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。我們對(duì)多個(gè)物種間的成熟miR-21序列進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其在多個(gè)物種間保持高度保守，提示miR-21在進(jìn)化過(guò)程中穩(wěn)定性和重要性十分顯著，進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能對(duì)于腫瘤等疾病的防治可能具有重要意義。

目前，生物信息學(xué)已成為研究miRNA最重要的工具之一。miRNA與靶基因的作用具有精密的時(shí)空調(diào)控特異性，一條miRNA通常具有調(diào)控多個(gè)基因的功能，而同一基因也可能接受多個(gè)miRNA調(diào)控，生物信息學(xué)可以對(duì)這些海量和復(fù)雜信息進(jìn)行分析和處理。hsa-miR-21作為一條致癌miRNA近來(lái)受到較多的關(guān)注［2-5，15］，我們綜合 Targetscan、PicTar及 MiRanda 等在線工具預(yù)測(cè)的hsa-miR-21靶基因以及研究證實(shí)的靶基因，進(jìn)行靶基因功能富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，得到hsa-miR-21靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Notch信號(hào)通路的正向調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，涉及Notch、細(xì)胞周期等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的結(jié)果。我們將以此為理論依據(jù)，同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步探討hsamiR-21參與消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

圖2 hsa-miR-21候選靶基因集合的功能富集分析結(jié)果Fig 2 GO analysis of candidate target genes of hsa-miR-21

圖3 hsa-miR-21候選靶基因集合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果Fig 3 Pathway analysis of candidate target genes of hsa-miR-21

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