缺血后適應聯用粒細胞集落刺激因子對心肌急性缺血再灌注損傷的保護作用

于宗良，陳樂，楊向軍

(1.江蘇大學附屬昆山醫院心內科，江蘇昆山 215300;2.蘇州大學附屬第一醫院心內科，江蘇蘇州 215006)

與缺血預適應相比，現有的研究相繼表明缺血后適應(ischemic postconditioning，IP)同樣可以減輕急性心肌缺血再灌注損傷，也可減少梗死心肌面積等［1-5］。粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是一類新型的拮抗心肌細胞凋亡、提高心肌細胞活力、促進血管新生的細胞因子［6-9］，因而將IP和G-CSF應用治療急性心肌梗死受到較多的關注，但確切的臨床療效仍有較大爭議［5，9］。本研究從心肌缺血再灌注損傷、心室重構以及超微結構等三方面，探究二者聯合應用對心肌缺血再灌注損傷的保護效應及其可能機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制作

體重在2.2～2.8 kg之間的健康雄性新西蘭白兔，3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉后開胸暴露心臟，在左心耳下緣與心尖連線中點之間的連接面上，采用雙線雙結法結扎心臟冠狀動脈左室支(LVA)［10］。以結扎局部心肌的搏動明顯減弱、蒼白，心電圖ST-T改變及血肌鈣蛋白I(cTnI)升高為模型制作成功標志。

1.2 藥物及劑量

G-CSF注射液(商品名:潔欣;蘇州中凱生物制藥;批號:藥準字 S19991002)，劑量為10μg·kg-1·d-1，采用皮下注射，缺血再灌注12 h后給藥，連用5 d。

1.3 分組及處理

將建模成功的動物隨機分為4組，即:單純缺血再灌注對照組(IR組)，松開結扎的線結后立即進行再灌注，12 h后開始皮下注射生理鹽水0.5 ml，每天1次，連續5 d;粒細胞集落刺激因子組(G-CSF組)，在單純缺血再灌注組的基礎上，于再灌注12 h后皮下注射G-CSF;IP組，在再灌注開始的1 min內通過周期性結扎和松解LVA的線結，進行缺血30 s/再灌注30 s的連續循環4次的IP處理，最后完全恢復左室支血流，再灌注12 h后皮下注射生理鹽水0.5 ml;G-CSF+IP組，聯合采用IP及G-CSF進行干預。所有受試白兔在再灌注15 min后縫合胸腔，精心飼養。在缺血再灌注以及治療過程中，增補死亡動物，保證每組完成實驗數為15只。

1.4 外周血白細胞計數及cTnI檢測

麻醉后抽取股靜脈血2 ml，分別進行外周血白細胞計數及cTnI檢測，飼養7 d后再次抽取股靜脈血測定cTnI及外周血白細胞計數。

1.5 超聲心動圖測定

4個實驗組的新西蘭兔飼養4周，使用二維切面及M超聲，測量左房內徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、左室舒張期末徑、左室收縮期末徑、左室短軸縮短率，估算射血分數(EF)以評價心功能。

1.6 組織病理學檢查

在超聲心動圖檢查后靜脈注射空氣處死兔，分離心臟進行大體標本檢查，壞死心肌染色并觀察超微結構。心臟標本于-80℃冷凍半小時后，采用振動切片沿左室長軸將左室橫切為厚約2 mm的薄片，在電子天平上稱重后置于1%TTC溶液染色。灰白色部分為梗死心肌，磚紅色部分為存活心肌，分離心肌，濾紙吸干染液后分別稱重。梗死心肌面積為梗死心肌重量與左室心肌總重量的百分比。采用透射電子顯微鏡(JSM-840)進行超微結構觀察。

1.7 統計學處理

所有數據整理和分析采用SPSS 13.0軟件完成。數值變量資料以±s表示，分類變量資料以百分比(%)表示，兩樣本均數的比較采用成組資料t檢驗，同一組處理前后的比較采用配對t檢驗，多組樣本均數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05作為差異有統計學意義的標準。

2 結 果

2.1 術中心電監測(缺血再灌注前后ST段變化)

實驗動物結扎LVA后數分鐘內，心電監護(Ⅱ導聯)就顯示ST段較結扎前明顯抬高;而在松結再灌注后，采用后適應處理的再灌注的兩組實驗兔的ST段回落明顯加快，和單純缺血再灌注組的差異具有統計學意義(P＜0.05)(表1)。

表1 缺血15 min及再灌注15 min對新西蘭兔Ⅱ導聯ST段的影響 mmTab 1 ST-segment(leadⅡ)resolutions before and after reperfusion in each group mm

2.2 外周血白細胞計數

從表2可以看出，和手術前相比，給予G-CSF可以明顯升高外周血白細胞數(P＜0.05)，這一結果顯示了G-CSF的造血動員作用。

2.3 cTnI含量的變化

術后7 d各組的cTnI含量均較術前有所升高，但G-CSF、IP、G-CSF+IP組的升高幅度明顯低于IR組(P＜0.05)(表3)。

表2 實驗動物術前及術后7 d外周血白細胞數Tab 2 WBC before and 7 d after operation in each group

表3 缺血再灌注各組術前及術后cTnI水平Tab 3 cTnI before and 7 d after operation in each group

2.4 心功能及心室重構

術后4周超聲心動圖檢查提示單純IR組的平均左室舒張末期直徑(LVIDd)最大，提示其收縮功能恢復最差;而IP+G-CSF組的心室重構最輕，LVEF也明顯優于其他3組(P＜0.05)，見表4。

表4 不同處理方式對缺血再灌注兔術后4周心功能的影響Tab 4 Ultrasound cardiography 4 weeks after operation in each group

2.5 梗死心肌面積

從表5可見，與 IR 組相比，G-CSF、IP、G-CSF+IP組心肌梗死面積均明顯減少。與G-CSF組及IP組相比，G-CSF+IP組梗死范圍稍小，但差異無統計學意義。

2.6 心肌細胞超微結構變化

采用透射電子顯微鏡觀察發現IR組肌絲排列紊亂，線粒體腫脹明顯，有部分空泡變。G-CSF組仍有肌絲排列輕度紊亂，但未見肌絲溶解，且線粒體腫脹也不明顯。IP組的肌絲排列稍不整齊，未見肌絲溶解，線粒體仍有腫脹。G-CSF+IP組的肌絲排列基本整齊，同樣未見肌絲溶解，大部分線粒體結構完整(圖1)。采用后適應、G-CSF干預后，肌絲和線粒體損傷程度均明顯減輕，G-CSF+IP組的減輕幅度最大。

表5 不同處理方式對缺血再灌注兔心肌梗死面積的影響Tab 5 The weight of LV，MI，and infarct size in each group

圖1 不同處理方式對缺血再灌注兔心肌細胞超微結構的影響 ×15 000Fig 1 Transmission electron microscope diversify of cardiomyocytes in each group ×15 000

3 討 論

防治急性心肌梗死的關鍵是采用急診冠脈介入治療、溶栓等措施進行及時再灌注，但是由此引發的再灌注損傷卻又大大降低了再灌注的獲益，因而有效預防再灌注損傷是提高急性心梗治療效果的重要保證。本研究率先采用IP優化再灌注同時給予促進心肌功能修復的G-CSF，發現與單純缺血再灌注相比，IP或GCSF均能顯著減輕心肌損傷、縮小梗死心肌面積，同時IP或G-CSF組的心室重構和超微結構損傷較IR組明顯減輕，而其中IP與G-CSF聯合應用的心肌保護作用較單用IP或G-CSF更好。

IP是指心肌急性缺血后在進行較長時間的再灌注之前，給予快速短暫的一次或數次重復缺血/再灌注，這一措施能夠提高心肌對缺血后再灌注損傷的耐受性，減少缺血/再灌注損傷［2］。如此同時，如何促進梗死心肌的修復則是另一難題，已有研究發現G-CSF能夠動員骨髓間質干細胞直接分化為心肌細胞，迅速趨化到受損心肌，促進壞死心肌的修復;G-CSF也可通過旁分泌機制促進血管再生，另外G-CSF還能直接作用于靶細胞上的受體抑制細胞凋亡來發揮細胞保護作用［9］。目前的動物實驗及部分臨床試驗已證實IP和G-CSF確實具有心肌保護作用，因而這兩者的臨床應用值得探討，特別是急診冠脈介入治療術的發展為IP和 G-CSF 的臨床應用提供了可行性［5，9］。

本實驗首次采用G-CSF聯合IP干預急性心肌缺血性梗死，首先IP可以減少再灌注損傷，其次外周血白細胞計數顯示采用G-CSF的劑量和給藥時間確實動員了機體骨髓干細胞，提示G-CSF的保護機制與細胞動員和誘導分化有關。我們的研究結果也表明，聯合應用G-CSF與IP治療急性心肌梗死不僅減輕缺血再灌注損傷，也促進了心功能的恢復，同時超微結構損傷的逆轉也為心肌的后期修復提供了物質基礎，而且聯合應用的效果明顯優于單獨應用。

我們的研究為IP與G-CSF的聯合應用治療心肌急性缺血再灌注損傷提供了一定的實驗依據和理論基礎，但是二者聯合治療的分子生物學機制、最佳的聯合治療方式等等尚需要更深入的研究。

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