吡格列酮對膠質瘤細胞生長的抑制研究

萬政強，陳晨，伏林山，孫關

(鹽城市第一人民醫院神經外科，江蘇鹽城 224001)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，由于生長位置特殊、惡性程度高以及血腦屏障的存在，目前臨床上膠質瘤治療效果極差［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ)的生物學功能復雜，參與調控脂肪和糖代謝、脂肪細胞終末分化、能量平衡，控制單核細胞分化成熟，誘導巨噬細胞凋亡，抑制炎癥反應，促進排卵，抗肝纖維化和動脈粥樣硬化，降血脂和血壓，并能夠誘導腫瘤細胞分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成［2］。近年來，PPARγ激動劑的抗腫瘤作用成為研究熱點，本實驗采用PPARγ激動劑吡格列酮處理細胞，研究吡格列酮對膠質瘤細胞生物學功能的影響及其相關作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人膠質瘤細胞系U251細胞購自中國科學院上海細胞庫，TUNEL及CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，β 連環蛋白(β-catenin)、MMP-2、Bad、Bax一抗購自Santa Cruz公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，吡格列酮購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養

細胞培養于含10%新生牛血清的DMEM培養基，并置于37℃、體積分數為5%的CO2孵箱中，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 β-catenin反義寡聚核苷酸設計合成

β-catenin反義寡聚核苷酸由上海吉瑪公司設計合成，其合成序列為5'-AAG TCC TGT ATG AGT GGG AAC-3'。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

各組細胞加吡格列酮處理后每孔1×104個細胞接種于 96孔培養板，加入培養液 100μl·孔-1，37℃、體積分數為5%的CO2培養24、48、72 h。檢測前4 h每孔加CCK-8溶液10μl，繼續孵育2～4 h，棄上清液，選擇490 nm波長，用酶標儀測定每孔吸光度值，取5孔的平均值，實驗重復3次。

1.5 劃痕試驗檢測細胞侵襲

取90%融合度的U251細胞經無血清DMEM同步化24 h，用無菌的移液管尖(約0.7 mm)在各培養板細胞生長單層的相同位置劃直線，分別用含100μmol·L-1吡格列酮和DMSO的DMEM培養液培養細胞過夜。分別于劃痕后12、24 h在顯微鏡下觀察細胞，隨機選取5個視野進行拍攝(×40)。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

各組細胞加吡格列酮處理后固定液固定細胞30 min，加配制好的 TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，抗熒光淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.7 Western Blot法檢測蛋白表達

各組細胞處理后收集細胞，RIPA裂解液裂解，收獲蛋白并行BCA法定量，40μg蛋白上樣于10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜并用5%脫脂奶粉于37℃條件下封閉1 h，一抗(β-catenin、MMP-2、Bad、Bax 1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，HRP 標記的二抗孵育1.5 h，以β-actin作為內參，將超敏發光液加在PVDF膜上，曝光顯影。

1.8 統計學處理

實驗均獨立重復3次，實驗數據用均數±標準差表示，采用SPSS 11.5統計軟件進行常規統計，行t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 吡格列酮對膠質瘤細胞生長的影響

選擇U251膠質瘤細胞株分別給予不同濃度吡格列酮(1、10、50、100、200 μmol·L-1)處理 1、3、5、7 d，采用CCK-8法檢測吡格列酮對膠質瘤細胞增殖活力的影響。如圖1所示:1、10、50 μmol·L-1的吡格列酮對膠質瘤細胞的生長無明顯抑制作用，100μmol·L-1的吡格列酮作用3 d后U251細胞增殖活力降至(54.6±2.8)%，且隨著藥物作用時間的延長，細胞增殖能力逐漸降低。將藥物濃度增加至200μmol·L-1后，U251細胞的生長明顯受到抑制。結果表明吡格列酮能抑制膠質瘤細胞的生長，且隨藥物濃度和作用時間的增加，細胞活力逐漸降低，呈藥物濃度-時間負性依賴方式。

圖1 CCK-8法顯示吡格列酮抑制U251細胞增殖，并呈時間-劑量依賴性

2.2 吡格列酮抑制膠質瘤細胞侵襲

劃痕損傷形成傷口模型后，劃痕邊緣的細胞以出芽的方式向外生長，導致傷口面積逐漸縮小。損傷24 h后，對照組約有80%的傷口面積重新融合，而吡格列酮組的傷口面積幾乎沒有改變。Western Blot檢測顯示，吡格列酮能顯著降低MMP-2的蛋白表達(P＜0.05)(圖2)，提示吡格列酮能增加膠質瘤細胞的黏附性，抑制細胞的侵襲和轉移。

圖2 A.劃痕試驗顯示吡格列酮抑制膠質瘤U251細胞侵襲;B.吡格列酮抑制MMP-2蛋白表達

2.3 吡格列酮對膠質瘤細胞凋亡的影響

TUNEL法發現吡格列酮處理細胞24 h后，顯微鏡下綠色熒光陽性細胞顯著多于對照組，提示吡格列酮能誘導膠質瘤細胞發生凋亡。同時，U251細胞中凋亡誘導蛋白Bad、Bax表達均上調，與對照組相比均差異有統計學意義(P＜0.05)(圖3)。結果表明，吡格列酮能夠促使膠質瘤細胞凋亡顯著增加。

2.4 吡格列酮抑制β-catenin蛋白表達水平

Western Blot法檢測發現吡格列酮處理U251細胞后，細胞內β-catenin蛋白表達水平逐漸降低，呈濃度-時間依賴方式(圖4)。

2.5 β-catenin siRNA抑制相關基因表達

U251細胞轉染β-catenin反義寡聚核苷酸發現，βcatenin siRNA明顯下調MMP-2蛋白，并激活促凋亡蛋白Bad和Bax的表達。見圖5。

3 討 論

吡格列酮是一種人工合成的高選擇性PPARγ激動劑，臨床上常用于治療Ⅱ型糖尿病，上市以來經過幾年的臨床使用尚未發現有明顯的副作用。近年來研究表明，吡格列酮具有抗腫瘤的功效，能抑制多種腫瘤細胞生長［3-5］，但是吡格列酮對膠質瘤細胞作用的研究鮮有報道。

圖3 A.TUNEL實驗表明吡格列酮誘導膠質瘤U251細胞凋亡;B.吡格列酮抑制凋亡相關蛋白Bad、Bax表達

圖4 隨著吡格列酮濃度的增加及作用時間的延長，β-catenin蛋白表達水平逐漸下調

圖5 β-catenin siRNA下調U251細胞中MMP-2蛋白表達，上調Bad、Bax蛋白表達

腫瘤發生最突出的特征是細胞異常增殖，因此本研究首先采用CCK-8法觀察了吡格列酮對膠質瘤U251細胞增殖活性的影響，結果發現隨藥物濃度和作用時間的增加細胞活力逐漸降低，呈藥物濃度-時間負性依賴方式。膠質瘤發生發展過程中主要以局部浸潤為主，腫瘤細胞從腫瘤中心向周邊正常腦組織侵襲，無包膜形成，造成手術界限不清，腫瘤組織無法完全切除，導致殘留腫瘤組織在顱內繼續生長是治療失敗及腫瘤復發的重要因素。遷移能力增強是腫瘤細胞侵襲的一個主要步驟;在膠質瘤細胞侵襲過程中，蛋白酶對細胞外基質(extacrellularmairix，ECM)的降解是另一個關鍵步驟。其中以基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproeteinases，MMPs)最為重要，幾乎能降解ECM和基底膜的所有成分，在ECM降解過程中起主導作用［6］。MMP-2是MMPs中一種重要的蛋白酶，與膠質瘤細胞的侵襲性密切相關［7-8］。本研究通過細胞劃痕實驗發現，吡格列酮能抑制膠質瘤U251細胞的遷移能力;Western Blot法檢測顯示，吡格列酮能顯著降低MMP-2的蛋白表達，提示吡格列酮能增加膠質瘤細胞的黏附性，抑制細胞的遷移和侵襲。

研究顯示，呈侵襲性的細胞可通過表達某些凋亡調節基因抑制細胞凋亡的發生。凋亡途徑障礙在腫瘤的發生發展中起著重要作用，促進惡性腫瘤細胞凋亡是腫瘤生物治療的重要方向。通過TUNEL熒光染色，本研究發現吡格列酮在抑制膠質瘤細胞生長和遷移的同時還促進了細胞的凋亡。在調節細胞凋亡的蛋白中，Bad和Bax蛋白是關鍵性凋亡誘導因子。我們的研究發現，吡格列酮可以上調膠質瘤細胞中Bad和Bax蛋白表達水平。

β-catenin是連環蛋白家族中的一員，它既是Wnt信號轉導通路中的一個重要組成部分，同時又是重要的細胞黏附分子和細胞骨架成分［9］。目前，β-catenin被公認為是一種原癌基因［10］。實驗結果顯示，吡格列酮能夠顯著降低膠質瘤細胞中β-catenin的蛋白水平。特異性敲除β-catenin后膠質瘤細胞中MMP-2表達下調，而Bad和Bax蛋白表達水平明顯上調。因此，我們認為吡格列酮的抗膠質瘤作用機制是通過調節βcatenin的表達介導的。吡格列酮通過抑制膠質瘤細胞中β-catenin的表達破壞其對下游靶基因的轉錄，從而抑制膠質瘤的發生。

本實驗研究證明，吡格列酮通過β-catenin介導抑制膠質瘤細胞生長，且通過下調MMP-2的表達降低細胞的侵襲能力，上調Bad和Bax水平來誘導膠質瘤細胞凋亡。上述結果提示吡格列酮對膠質瘤細胞具有抗腫瘤的功效，有望作為膠質瘤新的治療藥物，具有重要的臨床應用價值。

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