鵪鶉PGCs的傳代培養及鑒定

李玉芳洪志勇李 明張興峰林秀嬌李鴻翔莊益芬張文昌*

（1.福建農林大學動物科學學院 福州 350002；2.黃淮學院 河南駐馬店 463000）

原始生殖細胞（PGCs）是具有高度未分化的發育全能性細胞。自Waldeyer(1870)首先在雞胚的生殖腺中發現PGCs以來，人們對雞PGCs的體外培養和擴增進行了大量的研究。Chang等(1995)［1］將從2日齡雞胚血液中分離出的PGCs放在從5日齡雞胚中獲取的生殖原基細胞上培養5 d，發現PGCs增殖了近5倍，后來成功得到了嵌合體雞。Park［2］從5.5 d的雞胚生殖腺中分離PGCs并將其在體外培養4個月，然后分別用傳至3代和4代的PGCs制作嵌合體雞獲得了成功。Han等［3］將分離到的28期雞胚胎生殖腺的PGCs在不傳代的情況下離體培養了2個月。Petitte等［4］將不同類型的飼養層和培養液對雞胚胎干細胞的培養效果進行了比較。在國內，李碧春、安靜、謝蓓、秦潔等［5-8］分別成功對X期胚盤細胞及PGCs細胞進行離體培養與傳代。本試驗采用孵化6 d的雞胚胎制作成纖維細胞飼養層培養鵪鶉原始生殖細胞，并比較添加生長因子與不添加生長因子的效果，以及PGCs在培養過程中的生長情況。

1 材料與方法

1.1 試驗器材 CO2培養箱(日本三洋)、超凈工作臺(蘇州凈化集團制造)、孵化箱(北京海江孵化設備制造有限公司)、體視顯微鏡(Nikon SMZ-10)、玻璃毛細管、拉針儀、血細胞計數板、0.22 um微孔濾膜，六孔培養板、小牛血清（FBS）（Gibico）、BCIP/NBT 染色試劑盒（Amresco）、細胞計數分析儀（EG）。

1.2 試驗試劑 0.25%胰蛋白酶（Gibio）溶液、EDTA溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA；無 Ca2+、Mg2+的 PBS 溶液；Hank’s液、DMEM-F12 培養基(清大有為)、ES 細胞基礎培養液、0.1%明膠、絲裂霉素-C、bFGF、SCF、mLIF、福爾馬林-乙醇定影液。

1.3 鵪鶉PGCs的培養 (1)挑選生長良好的細胞，置于無飼養層、無LIF生長因子的培養液中培養，觀察細胞培養結果；(2)挑選生長良好的細胞，在有雞成纖維飼養層的情況下觀察細胞生長結果；(3)挑選生長良好的細胞，在添加LIF、SCF、bFGF(每孔分別添加10 uL配好的LIF、SCF、bFGF溶液)的雞成纖維飼養層上觀察培養情況。

1.4 鵪鶉PGCs的傳代 （1）觀察鵪鶉原始生殖細胞的生長情況，選擇細胞克隆生長良好，隆起明顯，形態未表現分化或剛剛表現分化跡象的細胞克隆進行初次傳代；（2）用口吸管和鎢絲針把選擇好的克隆挑出，剝離周圍的飼養層細胞，置于PBS中洗1次；（3）移入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA液中，37℃消化2～3 min；（4）用口吸管將細胞克隆從消化液中吸出，置于DMEM中洗2次；（5）移入細胞培養液中，用口吸管輕輕吹打并借助鎢絲針的作用將細胞團分散為細胞懸液，置于新制備的飼養層中培養。

1.5 鵪鶉PGCs的鑒定

1.5.1 形態學鑒定 借助倒置顯微鏡及解剖顯微鏡，觀察細胞集落的生長情況、外部特征。

1.5.2 堿性磷酸酶（AKP）染色反應 (1)取無菌蓋玻片放置在無菌培養皿中，加入0.1%明膠2 mL，使蓋玻片表面也均勻地涂有明膠；(2)取生長情況良好的原始生殖細胞克隆放在包被有明膠的蓋玻片上，置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養 24 h；(3)取已有原始生殖細胞的蓋玻片用福爾馬林-乙醇定影液固定15 min；(4)去掉固定液，用蒸餾水沖洗2次，加入 BCIP/NBT 染色液，37 ℃下染色 1.5～2 h；(5)用蒸餾水輕輕沖洗掉染色液，晾干后在倒置顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

從表1可看出，在添加生長因子的雞成纖維細胞飼養層上培養原始生殖細胞，存活率明顯比其他2種高；在雞成纖維細胞飼養層上培養的鵪鶉PGCs存活率比在基礎培養液中的存活率高。

表1 鵪鶉PGCs在不同培養條件下數量及存活率變化情況

在不含飼養層和生長因子條件下培養，基質細胞成纖維狀貼壁生長，原始生殖細胞的培養存活時間很短。培養2 d后以2～3個細胞的形式松散地聚在一起，并且很快出現分裂，形成的細胞團與周圍存在明顯界限，細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較強的脂狀小滴（見圖1）。第3 d其成活率為42.8%，培養4～5 d細胞大部分形成細胞團(見圖2)，培養5～6 d，基質細胞開始脫落死亡，原始生殖細胞也大部分死亡（見圖3）。

圖1 培養2 d分化中的鵪鶉PGCs（AKP染色）

圖2 形成4～5個細胞克隆的鵪鶉PGCs

圖3 原始生殖細胞在無飼養層及生長因子培養液中培養4～5 d

而當原始生殖細胞置放在雞胚成纖維細胞飼養層上時，細胞的分化得到了有效抑制，第2 d原始生殖細胞仍保持單個的未分化狀態(見圖4)，此時部分培養的原始生殖細胞體積變大，細胞內出現空泡（見圖5）。培養4～5 d后分化的程度比無飼養層的PGCs情況好，PGCs存活率為50%左右（見圖6）。

圖4 PGCs在雞成纖維細胞飼養層上的培養（2 d）

圖5 出現空泡的鵪鶉PGCs

圖6 在雞成纖維細胞飼養層上培養4～5 d的鵪鶉PGCs

在添加生長因子的成纖維細胞飼養層中培養，前3 d細胞基本不出現分化，保持單個的未分化狀態（見圖7），第4～5 d部分細胞開始出現分裂（見圖8）細胞存活 76%左右；培養至第 6～7 d，出現 7～8 個細胞的細胞克??；培養至第10 d時，細胞克隆為13～15個細胞左右，可見多個細胞的聚集，形態多樣，但多數呈島狀或巢狀（見圖9）。此時細胞形態不明顯，細胞間的接合不緊密，成纖維細胞大量死亡。換液傳代后鵪鶉PGCs仍然具有分裂增殖的能力（見圖10），經AKP染色后，仍著色較深，與剛分離的PGCs形態相似。試驗中PGCs傳代5次，細胞仍具有原始生殖細胞的形態，并保持其未分化狀態。

圖7 保持未分化狀態的鵪鶉PGCs

圖8 在含有生長因子的雞成纖維細胞飼養層上培養4～5 d的鵪鶉PGCs

圖9 鵪鶉PGCs培養10 d出現的細胞克?。ˋKP染色）

圖10 換液后正在分裂的PGCs（AKP染色）

3 討論

Swartz(1982)［9］發現在胚胎發育的 13～29 期，雞PGCs呈現堿性磷酸酶活性，里面含有大量的脂滴和糖原，在AKP反應中呈陽性，經AKP染色后呈紫紅色。本試驗在細胞的分離階段及培養階段對所獲得的細胞通過形態學及AKP染色進行鑒定，這些細胞與雞PGCs堿性磷酸酶染色形態相似，證明形態學及AKP染色法在鵪鶉PGCs的鑒定中一樣有效。

原始生殖細胞分離后，以游離的方式存在于培養液中，如果有其他基質細胞，則依附于其他細胞而暫時固定下來，但很容易分離。本試驗原始生殖細胞傳代過程即是利用了原始生殖細胞的游離性而分離的。

PGCs培養過程中的關鍵技術是維持PGCs的未分化狀態。胚胎及機體發育過程中分化和分裂增殖一般同時進行，而PGCs的建系要求PGCs既能快速無限增殖又能呈未分化狀態，因而抑制分化和擴增是一對矛盾。禽類PGCs常用雞胚成纖維細胞制作飼養層。雞胚成纖維細胞(CEF)能分泌LIF樣物質，用于制作培養基。鄒清雁等［10］用雞成纖維細胞飼養層分離培養雞的X期培盤細胞獲得了成功，并將類ES細胞傳至9代，AKP染色為陽性。安靜等（2003）［6］對雞的X期胚盤細胞在雞成纖維細胞飼養層上成功傳代，并對傳至4代的細胞克隆經形態學、AKP染色等方法檢測后表明其具有ES細胞的諸多特性。本試驗采用3種不同方法，在相同培養時期（4～5 d）對鵪鶉PGCs的細胞形態進行比較；同時對鵪鶉PGCs培養及傳代過程中的存活率、分裂、細胞分化方面進行了比較，發現雞胚成纖維細胞可在3種生長因子的作用下對胚胎干細胞提供營養支持8～9 d，論證了生長因子 LIF、bFGF、SCF 對 PGCs的抑制分化和促進分裂增殖的作用，與前人的試驗結果相似。本試驗嘗試在第7 d對鵪鶉PGCs傳代，傳至5代，AKP染色后發現仍有PGCs存活，部分細胞具有分裂增殖的能力。鵪鶉PGCs的成功傳代對于轉基因動物的制作及瀕危鳥類的物種保護具有重要的意義。

［1］ Chang I,Jeong D K,Hong Y H,et a1.Production of germline chimeric chicken by transfer of cultured chick primordial germ cells［J］.Cel Biol Int,1997,21:495-499.

［2］ Park T S,Han J Y.Derivation and characterization of pluripotent embryonic germ cells in chicken［J］.Mol Reprod and Deve,2000,56:475-482.

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［4］ Petitte J N,Liu G,Yang Z.Avian pluripotent stem cells［J］.Mech Dev,2004,121:1159-1168.

［5］ 李碧春,秦潔.雞胚不同發育時期原始生殖細胞的分離方法［J］.動物學報,2003,49(6):835-842.

［6］ 安靜,杜立新.雞胚胎干細胞的分離、培養與鑒定［J］.動物學報,2003,49(5):698-703.

［7］ 謝蓓,黃海,胡小芬,等.雞胚胎原始生殖細胞體外培養［J］.細胞生物學雜志,2005,27:225-229.

［8］ 秦潔,李碧春,陳國宏,等.雞胚胎原始生殖細胞的培養和傳代［J］.動物學報,2005,51(4):723-731.

［9］ Swartz W J.Acid and alkaline phosphatase activity in migrating primordial germ cells from the early embryo［J］.Anat Rec,1982,202:375-385.

［10］ 鄒清雁,張淑蓮,鄭曲波,等.雞胚胎干細胞飼養層培養體系的建立［J］.上海實驗動物科學,2000,20:206-209.