Notch信號通路分子在舌鱗癌中的表達及意義

張同韓等

[摘要] 目的 明確Notch信號通路受體Notch1、Notch3及其配體Jagged1、Jagged2在舌鱗癌中的表達及其意義。方法 通過逆轉錄聚合酶鏈反應、免疫組織化學和Western blot檢測74例舌癌患者的組織標本（舌癌及癌旁組織）和人舌癌Cal-27細胞株中Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA與蛋白質的表達水平，分析其與細胞增殖及臨床病理的關系。結果 舌癌、癌旁組織及Cal-27細胞株中均檢測到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA和蛋白質的表達。Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表達率高于癌旁組織，而Jagged1和Jagged2蛋白在舌癌和癌旁組織中的表達率無明顯差異。Notch1和Notch3蛋白的表達和舌癌的臨床分期具有相關性。4種信號蛋白的表達與患者的年齡、性別和臨床病理分級無相關性。Notch3和Jagged2的表達具有相關性。Notch1蛋白在淋巴結轉移陽性病例中的表達率高于轉移陰性的病例，Jagged1在轉移陽性病例的表達分級高于陰性病例。結論 Notch信號通路分子在舌鱗癌中表達活躍，與舌癌的發生發展有重要的相關性。

[關鍵詞] 口腔癌； 口腔黏膜； Notch； Jagged1； 信號轉導； 舌癌

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.021

Notch信號途徑是由配體、受體以及下游的DNA結合蛋白構成的連鎖信號通路；配體包括Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4等，受體包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4等[1-2]，其下游蛋白有HES1

和HES5等[3]。雖然這些配體和受體在結構上有諸多

相似之處，但作用迥異[2]。Notch信號通路可以參與

多種細胞過程[4]，其異常與各種腫瘤的發生有關[5]；

根據細胞類型和組織類型不同而具有抑瘤或者促瘤作用[6]，在同一組織不同疾病中也可能具有抑瘤或者

促瘤作用[7]。本研究擬探討Notch1、Notch3、Jagged1

和Jagged2的mRNA與蛋白質的表達水平，并研究其與患者的臨床病理特征之間的聯系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例 選取2005—2007年間在中山大學光華口腔醫學院·附屬口腔醫院診斷為舌癌并行手術治療的74例患者采集樣本；所有病例均為未經放化療的原發病例，年齡為25～77歲，平均年齡54.5歲，男性40例，女性34例；TNM分期和病理分級見表1。

1.1.2 組織標本的收集 所有標本均為術中獲取，癌旁標本取自舌癌邊界以外2 cm的舌黏膜，均經病理證實。標本一部分放入-80 ℃保存，準備提取RNA和蛋白質；另一部分放入甲醛溶液中固定，石蠟包埋后采用免疫組織化學染色。

1.2 細胞株

人舌鱗狀上皮癌細胞株Cal-27購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）。

1.3 引物

本實驗用于逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse trans-

criptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）的引物由大連TAKARA公司合成，引物序列見表2。

1.4 實驗方法

Cal-27細胞采用免疫熒光化學染色，按照常規方法操作，進行異硫氰酸熒光素（fluorescein isothio-cyanate，FITC）標記和二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）染色；臨床組織樣本采用免疫組織化學染色，按常規方法操作。細胞總RNA的提取按試劑盒說明書操作，RNA質量檢測合格后，通

過逆轉錄獲得的cDNA即可用于聚合酶鏈反應（poly-

merase chain reaction，PCR）。PCR擴增按下列程序做循環：Notch1、Jagged1、Jagged2和β-actin，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火51 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；Notch3，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，61.8 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環。上述所有反應到最后都要在72 ℃下總延伸10 min，完成后電泳。組織蛋白提取后，根據質量濃度調整上樣量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），采用槽式濕轉法轉膜，進行Western blot。

1.5 結果判定

1.5.1 免疫組織化學染色 400倍光鏡下盲法讀片，細胞內有棕黃色染色者為陽性。選取10個隨機的不同的視野，計數陽性細胞數Y和細胞總數T[8]，求出

每例的Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2的陽性標記指數L。L=Y/T×100%。以L值的大小進行分級，表示染色強度的強弱：0級（L=0），1級（0

1.5.2 PCR與Western blot相對表達量的測定 各樣本Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2的相對表達量為Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2條帶灰度值與內參照β-actin條帶灰度值的比值。

1.6 統計學分析

實驗重復3次，以x±s描述結果。采用SPSS 13.0軟件用方差分析和卡方檢驗進行統計學分析，若方差不齊者采用秩和檢驗，若條件不滿足卡方檢驗者采用Fisher法；檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 RT-PCR的擴增結果

2.1.1 Notch信號分子mRNA在舌癌細胞株中的表達

RT-PCR的擴增結果見圖1：Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA在Cal-27中均有表達。

2.1.2 Notch信號分子mRNA在臨床組織標本中的表達 在舌癌及癌旁組織中均可檢測到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA的表達（圖2）。對凝膠電泳結果進行灰度分析，舌癌組織中的相對表達量較癌旁組織高，二者的差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 Western blot測定結果

在Cal-27細胞株、舌癌和癌旁組織中均檢測到了Notch信號蛋白的表達，與免疫組織化學和RT-PCR的結果一致（圖3、4）。

2.3 免疫組織化學分析

2.3.1 Notch信號蛋白在Cal-27細胞株中的表達 通過免疫熒光化學法檢測到Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2在Cal-27細胞株中的表達見圖5。細胞中Notch1、Notch3主要表達在細胞質內及細胞膜，部分表達在細胞核內；Jagged1主要表達在細胞膜，少部分弱表達于細胞質內；Jagged2主要表達在細胞質及細胞膜。

1：病例1的舌癌組織；2：病例1的癌旁組織；3：病例2的舌癌組織；4：病例2的癌旁組織。

2.3.2 Notch信號蛋白在臨床組織標本中的表達 在腫瘤及癌旁組織內，Notch1大部分表達在細胞質內，偶爾表達在細胞膜和細胞核內；Notch3在細胞膜、細胞質和細胞核均有表達；Jagged1和Jagged2主要表達在細胞質和細胞膜上。在癌旁組織內，Notch1強烈和廣泛地表達于基底層和棘層，而微弱和局限地表達于顆粒層和角化層（圖6A）；Notch3強烈和廣泛地表達于基底層和棘層（圖6B）；Jagged1強烈和廣泛地表達于基底層和棘層，而微弱和局限地表達于顆粒層和角化層（圖6C）；Jagged2強烈和廣泛地表達于基底層（圖6D）。Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2在

舌癌腫瘤細胞中均有表達（圖7）。

2.4 Notch1和Notch3在舌癌的表達率高于其在癌旁

組織的表達率

Notch受體和配體蛋白在舌癌及癌旁組織的表達率有所不同。Notch1在癌旁組織的表達率為36.5%（27例），而在舌癌中的表達率為56.8%（42例），明顯高于癌旁組織（2=6.10，P=0.013）。Notch3在癌旁組織的表達率為47.3%（35例），在舌癌中的表達率為63.5%（47例），高于癌旁組織（2=3.94，P=0.047）。Jagged1

在癌旁組織中的表達率為90.5%（67例），在舌癌組織中的表達率為97.3%（72例），二者差異無統計學意義（2=2.96，P=0.166）。Jagged2在癌旁組織中的表達率為74.3%（55例），在癌組織中的表達率為83.8%（62例），二者差異無統計學意義（2=2.00，P=0.157）。

2.5 Notch受體和配體蛋白在舌癌的表達與臨床病

理特征的相互關系

Notch信號分子的表達陽性率與舌癌患者的年齡、性別、臨床分期、淋巴結轉移，以及病理分級間的關系見表3。Notch1和Notch3的表達和臨床分期有相關性（P<0.05），而Jagged1和Jagged2則與臨床分期無相關性（P>0.05）。Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2與病理分級及性別無相關性（表3）。Notch3和Jagged2的表達有相關性（表4），其他的則無相關性。Notch1在有淋巴結轉移病例的表達率明顯高于無淋巴結轉移的病例（表3）。因為只有2個病例不表達Jagged1，所以本研究分析了Jagged1表達分級（0、1和2、3）與有無淋巴結轉移的病例間的關系，結果顯示，Jagged1在有淋巴結轉移的病例中表達分級更高（表5）。

3 討論

細胞功能的調節、腫瘤發生相關微環境的調控均有Notch信號參與[4]。Notch信號在腫瘤發生中既可發揮抑瘤作用，也可發揮促瘤作用，這取決于細胞和組織的類型[4，9]。在本研究中，在Cal-27細胞株、舌癌和癌旁組織中均檢測到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA的表達，且其表達水平在舌癌中高于癌旁的舌黏膜組織。Notch信號蛋白分子明顯表達于腫瘤細胞，在腫瘤組織和癌旁組織的表達水平有明顯的差異，微弱和局限地表達于癌旁舌黏膜組織，但廣泛和強烈地表達于舌癌組織；Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表達率亦高于癌旁組織：以上結果提示Notch信號通路的受體和配體在舌癌中可能起著癌基因的作用。本研究結果與其他學者[9-11]的研究結果相似。Yao等[10]報道，應用γ-secretase抑制劑L-685、L-458下調Notch1的表達可抑制人舌癌Tca8113細胞系的生長，伴隨著舌癌細胞的周期停滯和細胞凋亡。Panelos等[9]研究認為，Notch1在非陽光暴露處鱗狀細胞癌中的表達是上調的。Hijioka等[11]研究了Notch途徑的基因在細胞系（人口腔鱗癌細胞株Ca99-2、HSC-2和HSC-4）和腫瘤中的表達，發現與正常口腔組織

中這些基因的表達相比，Notch1、Notch2和Jagged1的表達水平上調，這表明Notch信號在口腔鱗癌中表達活躍。這些研究結果表明，Notch信號通路在舌鱗癌中是被激活的。

Notch信號通路參與了人類的發育過程，在此過程中它有3種作用類型：二元譜系定向、側向抑制和邊界形成[12]。人類一生中，表皮一直都不停地更新，這個過程是由表皮基底膜的干細胞完成的。由周圍的角化細胞發出的Notch信號可以引起基底干細胞的分化，在干細胞簇的邊界，Notch信號可刺激人體表皮分化[13]。已有研究[13]顯示，富含干細胞的基底角化細胞簇比其周圍的細胞表達更高水平的Notch信號分子。Notch受體、配體和通路中的其他組分在脊椎動物表皮的不同分化階段的角化細胞均有表達[14]。Notch受體及其配體在宮頸鱗癌表達上調，提示Notch信號可能參與調控人角化細胞的增殖[15]。異常的Notch信號可以引起上皮癌變，例如鱗癌、基底細胞癌和惡性黑色素瘤[16]。Notch信號分子也可作為腫瘤干細胞標志物在口腔上皮異常增生和口腔鱗癌的發生中起重要作用[17]。Notch信號通路成員的失調引起細胞的定向發生和分化信號異常，導致了口腔鱗癌的發生[18]。Casey等[19]報道，Jagged2在整個口腔上皮細胞都有表達并且是口腔上皮細胞分化過程中Notch1激活所必須的。本研究結果中，Notch信號分子在舌黏膜基底層的表達高于其他層，而在舌鱗癌細胞的表達強烈而彌漫，這些特征可能表明Notch信號的上調阻止了舌黏膜基底層干細胞的分化。Notch信號在舌癌發生中起著致癌作用，通過調節舌鱗癌細胞的分化而參與舌癌的發生。信號分子可能對控制正常舌黏膜上皮細胞的分化有重要貢獻。類似的研究[20-21]表明，在前列腺癌和宮頸癌中Notch信號的激活是依賴Jagged1的。

本研究結果表明，Notch1和Notch3表達與舌癌的臨床分期具有相關性，這意味著，Notch信號通路可能與舌鱗癌的發展有相關性；Notch3和Jagged2表達有高度相關性，提示在舌鱗癌中Jagged2與Notch3可以相互作用而產生致瘤作用，但其具體機制還需要研究；在頸部淋巴結轉移陽性的舌癌病例中，Notch1和Jagged1表達率高于陰性病例：這些發現支持一個模型，那就是Jagged1蛋白水平的失調在舌癌進展和轉移中發揮了作用，并提示Jagged1可能是區分舌鱗癌侵襲性強與弱的參考指標[20-23]。Sahlgren等[22]已經證明，Notch信號是缺氧刺激誘導上皮間質轉化（epi-thelial-mesenchymal transitions，EMT）、增加遷徙和侵襲所必需的；抑制Notch信號可以廢除缺氧誘導的EMT和侵襲，與此相反，Notch活化形式可以替代缺氧誘導這些過程而誘導EMT。研究[24]顯示，Notch可調控Slug阻斷Notch信號，抑制體內腫瘤模型的生長和轉移；Jagged1激活的Notch信號通過調控Slug抑制E-cadherin而促進EMT。Jagged1和Hey1是Notch信號通路的一個靶基因，也參與介導轉化生長因子-β誘導的EMT[25]。基于上述實驗的結果，筆者推測Jagged1可能通過參與調控EMT而在舌癌的侵襲和轉移中發揮重要作用。

總之，Notch信號可以影響舌生理狀態下的生長發育和舌癌病理情況下細胞的增殖、分化和存活。Notch信號途徑參與舌癌發生的分子機制是十分復雜的，雖然目前的研究逐漸深入，但距離完全闡明仍有很長的路要走。闡明精確的信號通路途徑將為應用Notch通路的相關分子作為靶點治療舌癌提供重要依據。

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（本文編輯 吳愛華）