細胞角蛋白19和間隙連接蛋白43在4—亞基硝氧喹啉誘發大鼠舌黏膜癌變過程中表達的研究

馮燕　康曉潔　黎春暉　聶敏海

[摘要] 目的 研究4-亞基硝氧喹啉（4NQO）誘發大鼠口腔黏膜癌變過程中細胞角蛋白19（CK19）和間隙連接蛋白43（Cx43）的表達，探討口腔黏膜癌變過程中CK19與Cx43的相關性。方法 利用4NQO誘導SD大鼠的口腔黏膜癌變，運

用免疫組織化學的方法檢測CK19、Cx43在口腔黏膜癌變過程中各階段的動態變化。結果 在大鼠正常舌黏膜組織中，CK19陽性染色的細胞散在分布于黏膜基底層；隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，CK19表達于黏膜基底上層；在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）組織中，CK19陽性染色細胞分布在黏膜各層。CK19在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中陽性表達率分別為30.00%、50.00%、58.33%、80.00%、91.67%，差異有統計學意義（P<0.05）。在正常舌黏膜中Cx43蛋白主要表達于大鼠舌黏膜上皮細胞的細胞膜上，上皮

的基底層、棘層和顆粒層呈陽性染色。隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，Cx43的表達明顯下降。Cx43在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中陽性表達率分別為100.00%、85.71%、66.67%、40.00%、33.33%，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 在大鼠舌黏膜癌變過程中，CK19蛋白表達水平隨病變程度加重顯著升高，提示CK19與口腔上皮細胞的癌變有關；Cx43蛋白表達水平隨病變程度加重顯著下降，Cx43表達下降是口腔黏膜癌變的早期事件。CK19與Cx43蛋白表達呈負相關，CK19和Cx43的聯合檢測對OSCC的早期診斷有重要的作用，有利于提高OSCC早期診斷的靈敏度和特異性。

[關鍵詞] 口腔鱗狀細胞癌； 細胞角蛋白19； 間隙連接蛋白43； 免疫組織化學

[中圖分類號] R 739.8 [文獻標識碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.006

口腔癌發病率居頭頸部惡性腫瘤的第二位，其中90%以上為鱗狀細胞癌，5年生存率為50%[1]。早發現、早診斷和早治療是目前提高口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者生活質

量和生存率的關鍵所在。細胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）為Ⅰ型角蛋白，主要表達于單層上皮的上皮細胞，也散在表達于復層鱗狀上皮的基底層細胞[2-3]。其在口腔頜面部多種病變中均有表達，但是

口腔中的研究多局限于檢測不同分化程度鱗癌組織中CK19的表達變化，缺乏對其在口腔黏膜癌前病變的動態研究。該蛋白能否作為早期診斷OSCC的指標未進行深入研究，也未得出一致結論。

在腫瘤細胞以及轉化細胞普遍存在細胞間隙連接通訊（gap junctional intercellular communication，

GJIC）的缺陷[4]，在細胞間隙連接蛋白（connexin，Cx）家族中Cx43分布最為廣泛，受到了廣泛關注和深入研究。近年來的研究發現，Cx43蛋白在多種正常組織中高表達，但在相應的癌組織中出現表達下調、異位表達或表達缺失[5-8]。GJIC缺陷與腫瘤的發生發展密切相關，但與口腔黏膜癌變的相關性的研究資料較少。

本文通過觀察CK19和Cx43在SD大鼠口腔黏膜癌變過程中的表達，從而探尋CK19和Cx43與口腔黏膜癌變的關系及意義。

1 材料和方法

1.1 標本

隨機選取58只雄性SD大鼠，3～4只一籠同室飼養，均用常規飼料喂養。分為實驗組（48只）和對照組（10只）。實驗組大鼠飲用水中加入4-亞基硝氧喹啉（4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO）（40×10-6 mg·L-1）誘癌，分批處死，取舌體組織；對照組飲自來水，與最后一批實驗組動物同時處死，取舌體組織。切取的組織包埋切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，由2位有經驗的病理醫師進行病理診斷。本實驗根據病理診斷結果，對58例標本進行分組：正常黏膜組10例；輕度上皮異常增生組14例；中度上皮異常增生組12例；重度上皮異常增生組10例；OSCC組12例。

1.2 方法

采用免疫組織化學SP法來觀察CK19和Cx43在SD大鼠口腔黏膜癌變過程中表達的變化，染色過程中設陽性和陰性對照。CK19用已知陽性切片作為陽性對照，Cx43用已知陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。兔抗大鼠CK19（M259）多克隆抗體和兔抗大鼠Cx43（S369）多克隆抗體、免疫組化試劑盒SP-9000 HistostainTM-Plus Kits和顯色試劑盒（即用型DAB顯色試劑盒）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 觀察方法和結果判定

觀察由本研究者在有經驗的病理醫生指導下完成。CK19陽性染色部位為細胞漿和細胞膜，以細胞漿和細胞膜中出現黃色或棕黃色著色為陽性染色；Cx43蛋白以細胞膜或細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性。隨機選擇5個高倍視野（400倍）計數陽性細胞數，以確定每個視野的陽性率；取其平均值作為該例的陽性率，并判定細胞染色強度。綜合染色強度和陽性率進行分析處理。染色強度評分標準：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；陽性細胞比例評定標準：<5%為0，5%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4。2項結果相加記為標記指數（labeling index，LI），并通過LI判斷表達強度和表達陽性率。<2為陰性（-），2～3為弱陽性（+），4～5為中度陽性（++），6～7為強陽性（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數據進行分析，組間比較采用多個樣本比較的秩和檢驗、多個樣本間兩兩比較的秩和檢驗及2趨勢檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CK19在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的表達

在大鼠正常舌黏膜組織中，CK19陽性染色的細胞散在分布于黏膜基底層，基底上層不表達；隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，CK19表達于黏膜基底上層；在OSCC組織中，CK19陽性染色細胞分布在黏膜各層，浸潤到黏膜下組織的癌細胞也呈陽性染色（圖1）。

CK19在大鼠正常舌黏膜、上皮異常增生、鱗狀細胞癌組織中的表達情況見表1。由表1可見，在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中CK19陽性表達率分別為30.00%（3/10）、50.00%（7/14）、58.33%（7/12）、80.00%（8/10）、91.67%（11/12）。正常舌黏膜與重度上皮異常增生和OSCC，輕度上皮異常增生與重度上皮異常增生和OSCC，中度上皮異常增生與OSCC，兩兩組相比較，差異有統計學意義（P=0.001），說明正常舌黏膜、上皮異常增生和OSCC表達CK19差異有統計學意義。隨著病變程度加重，CK19表達強度增強，陽性率增加（2趨勢=10.771，P<0.05）。

2.2 Cx43在大鼠舌黏膜癌變各階段組織中的表達

在正常舌黏膜中Cx43蛋白主要表達于大鼠舌黏膜上皮細胞的細胞膜上，上皮的基底層、棘層和顆粒層呈陽性染色，在角質層中未見其表達。隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，Cx43蛋白的表達明顯下降；在OSCC組織中，Cx43陽性染色分布于癌細胞細胞漿以及鱗狀細胞癌組織中的角化珠內（圖2）。

Cx43在大鼠正常舌黏膜、上皮異常增生、鱗癌組織中的表達情況見表2。由表2可見，在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中的陽性表達率分別為100.00%（10/10）、85.71%（12/14）、66.67%（8/12）、

40.00%（4/10）、33.33%（4/12）。正常舌黏膜與中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC，輕度上皮異常增生與重度上皮異常增生、OSCC，中度上皮異常增生與OSCC，兩兩組相比較，差異有統計學意義（P<0.05），說明在正常舌黏膜、上皮異常增生和OSCC組織中Cx43表達隨著病變程度增加而顯著降低（2趨勢=15.536，P<0.001）。

2.3 大鼠舌黏膜癌變過程中CK19和Cx43的相關性

鼠舌黏膜癌變過程中CK19和Cx43的相關性見表3。Spearman相關分析發現：在大鼠舌黏膜癌變各階段中CK19和Cx43的表達具有相關性，呈負相關（相

關系數r=-0.889，P=0.000），隨病變程度加重，Cx43表達下降，而CK19表達增強。

3 討論

OSCC是最常見的口腔惡性腫瘤，近年來OSCC的發病率有增多趨勢，而且發病年齡有減小趨勢，嚴重危害人類的健康與生命。口腔黏膜上皮異常增生約有4%～16%的癌變率，所以對其發生演變的病因學研究尤為重要[9]。本實驗結果顯示大鼠正常舌黏膜組

織中，CK19陽性染色的細胞散在分布于黏膜基底層，基底上層不表達；隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，CK19表達于黏膜基底上層；在OSCC組織中，CK19陽性染色細胞分布在黏膜各層，浸潤到黏膜下組織的癌細胞也呈陽性染色。與其他研究[10-12]結

果相似。此外本實驗結果顯示：在正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中CK19陽性表達率差異有統計學意義（P<0.05），說明正常舌黏膜、上皮異常增生和OSCC表達CK19差異有顯著性，隨著病變程度加重，CK19陽性率顯著增加，表達強度顯著增強，與其他研究[11]結果相似；OSCC組與正常舌黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生組比較差異有統計學意義，重度上皮異常增生組與正常舌黏膜、輕度上皮異常增生組比較差異有統計學意義。目前的研究也表明CK19可能和癌基因有關，如在早期宮頸癌、肺癌、甲狀腺乳頭狀微小癌中可出現腫瘤微轉移，此時CK19與正常組織就已出現表達差異。

在Cx家族中Cx43分布最為廣泛，受到了廣泛關注和深入研究。本實驗發現Cx43蛋白主要表達在大鼠舌黏膜上皮角質形成細胞的細胞膜，在正常舌黏膜上皮的基底層呈弱陽性染色，棘層和顆粒層呈強陽性染色，角質層陰性染色，這種表達規律與其他研究[5-8]結果相似。由此推斷Cx43的表達分布情況可能與細胞的分化程度相關；Cx43可能是口腔黏膜早期癌變的一種生物標志物。

本實驗還發現隨著大鼠舌黏膜上皮異常增生程度的增加，Cx43蛋白表達明顯下降；在OSCC組織中Cx43異位表達，分布在鱗癌細胞的胞漿及鱗癌組織中的角化珠。筆者推斷Cx43的分布狀態可能與細胞所處周期相關。在DNA合成期，Cx43既位于胞漿又分布在胞質囊泡和其他胞內間隔；在分裂期，Cx43幾乎全部位于胞漿，并呈分散的點狀積聚[7]，而舌癌

組織中的癌細胞正好處于快速分裂增殖期。許多免疫組織化學研究已證實Cx43蛋白表達的量與GJIC的能力密切相關，Cx43表達的下降意味著GJIC功能的下降。本研究動態觀察了Cx43在4NQO誘導的SD大鼠舌黏膜從正常-輕度上皮異常增生-中度上皮異常增生-重度上皮異常增生-鱗狀細胞癌這一動態癌變過程中的表達變化，Cx43表達強度的變化在正常舌黏膜與輕度上皮異常增生組織的比較中無明顯差異；但隨著癌變程度增加而顯著降低，差異有顯著性。證實了Cx43表達異常可以發生在癌變的各個階段，提示在大鼠舌黏膜癌變早期發生了Cx43表達下調。因此筆者推斷Cx43表達下調可能是口腔黏膜癌變過程的早期事件，與口腔黏膜癌變的發生密切相關。

細胞角蛋白是細胞骨架體系中性質最為穩定的組分，在細胞質中起支架作用，對維持上皮細胞的形態和連續性起重要作用，與細胞分化、信號轉導、遷移、轉化、凋亡、基因調控等生命活動相關；而GJIC是相鄰細胞間直接交換信息、物質和能量的唯一通道，是維持多細胞組織穩定必不可少的調節機制。GJIC是通過細胞間隙連接（gap junction，GJ）實現的，其基本組成單位是跨膜的Cx，Cx43是一種主

要的細胞間隙連接蛋白，Cx43組成的連接子在質膜上常成簇出現形成間隙連接斑，同樣作為維持細胞穩定的成分，兩者的表達是否有相關性呢？本研究發現：在大鼠舌黏膜癌變發展中CK19、Cx43蛋白表達呈負相關。隨著病變程度加重Cx43表達下降，而CK19表達增強，推測鱗狀細胞癌組織中Cx43下降使得Cx表達減少，腫瘤細胞的轉移和種植增加，因而使得檢測上皮細胞及上皮起源腫瘤微轉移的標志物CK19表達增多，為鱗狀細胞癌早期診斷及預后判斷提供依據。CK19和Cx43的聯合檢測對OSCC的早期診斷有重要的指導作用，有利于提高OSCC早期診斷的靈敏度和特異性。

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（本文編輯 杜冰）