簡單快速的多糖植物雙生病毒核酸提取方法

郭靈芳，張長青，魯紅學，孫正祥，章松柏，張友軍，吳祖建

（1.長江大學工程技術學院，湖北荊州 434020；2.長江大學農學院，湖北荊州 434025；3.福建農林大學植物病毒研究所，福建福州 350002；4.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

1 雙生病毒

雙生病毒（geminiviruse）是植物病毒中唯一的一類具有孿生顆粒形態的單鏈環狀DNA 病毒，病毒粒子的大小約為18nm×30nm，無包膜，基因組為單組分或雙組分結構，大小為2.5～3.0kb，通常由昆蟲介體以持久性方式傳播，大多侵染寄主植物的韌皮部組織［1－3］。雙生病毒一般發生在熱帶、亞熱帶地區，溫帶地區也偶有發生。20世紀90年代后該病毒在世界范圍內大面積爆發，并在多種重要作物上引起嚴重危害，其中番茄、木薯、棉花和煙草是遭受雙生病毒危害最嚴重的作物，給種植者造成巨大經濟損失［4］。20世紀90年代以前，雙生病毒引起的病害在我國發生范圍小、危害不大。但90年代以后，廣西、云南等地相繼發現煙草、番茄、南瓜和番木瓜等作物遭受雙生病毒危害，并且發生范圍逐年擴大，危害程度日益加深，如:廣西的番木瓜和番茄發病普遍，發病嚴重地區病株率高達30%～50%［5－8］；2006年上海和浙江先后發現雙生病毒危害番茄后，該病害在華東地區迅速蔓延開來，造成嚴重危害［9］。

隨著雙生病毒危害的加重，快速檢測和鑒定病原十分必要。目前應用于雙生病毒的檢測手段主要有血清學方法、核酸雜交、聚合酶鏈式反應（PCR）、RCA（rolling circle amplifieation）等方法。盡管已經得到了一些雙生病毒的多克隆抗體或單克隆抗體，但由于雙生病毒血清關系有遠有近，限制了血清學方法的應用［10］。核酸雜交、PCR、RCA 3種方法都基于雙生病毒基因組核酸的方法，比較特異和靈敏，廣泛應用于雙生病毒的檢測和鑒定。雙生病毒基因組核酸的提取質量對檢測結果影響很大，特別是從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質的植物中提取的雙生病毒基因組核酸。從這些植物中分離出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、單寧等物質與DNA 會結合成黏稠的膠狀物，獲得的DNA 常出現產量低、質量差、易降解等問題，影響DNA 質量和純度，不能被限制性內切酶酶切，嚴重的甚至不能作為模板進行PCR 擴增［11－13］。此外，雙生病毒基因組是單鏈環狀的DNA，在大小和性質上都與寄主基因組DNA 不同，完全用植物基因組DNA 的提取方法提取雙生病毒基因組，可能會對其產率有一定的影響。基于此，在傳統雙生病毒基因核酸提取方法的基礎上，結合總DNA 提取的CTAB 法和質粒提取的離心柱方法，探索一種簡單快速的多糖多酚植物雙生病毒基因組核酸的提取方法。

2 材料與方法

2.1 材料

植物樣品:朱槿曲葉病病株和朱槿健株，病株和健株葉片采集于福建省福州市郊區，經過鑒定（病毒為Cotton leaf curl Multan virus）后保存于－70 ℃超低溫冰箱中備用。

2.2 CTAB法提取植物的總DNA

取約0.1g朱槿葉片（病株葉片3 份，即3 次重復），在液氮中研磨成粉末，加入700μL、65 ℃預熱的2×CTAB提取緩沖液，溫和混勻；65 ℃保溫30～60 min，期間不時搖動，使其充分混勻；用等體積的24∶1氯仿／異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合，于室溫下10 000r／min離心10min，回收水（上）相；用等體積的氯仿／異戊醇抽提，顛倒混勻，離心，回收上層水相；取上清，加入等體積的異丙醇，混勻，－20 ℃放置20min后12 000r／min離心10min以沉淀DNA；棄掉上清，加入適量的75%乙醇清洗、沉淀一次，隨后12 000 r／min離心10min；棄掉上清液，干燥后加入50μL 的TE溶液以溶解DNA，－20 ℃貯存備用。

2.3 離心柱法提取植物的總DNA

選用特別適用于多酚、多糖含量高的植物組織的植物總DNA 提取試劑盒DP305－02（北京天根生化科技有限公司），具體操作見說明書，朱槿葉片取0.1g（健株葉片1份、病株葉片3份，即3次重復），最后用50μL TE溶液溶解DNA，－20 ℃貯存備用。

2.4 改進后的植物總DNA提取方法

取約0.1g 朱槿葉片（病株葉片3 份即3 次重復），在液氮中研磨成粉末，加入700μL、65 ℃預熱的2×CTAB提取緩沖液，溫和混勻；65 ℃保溫30min，期間不時搖動，使其充分混勻；用等體積的24∶1 氯仿／異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合，于室溫10 000r／min離心10min，回收水（上）相；加入0.7倍體積的A 溶液（4～5 mol／L 鹽酸胍，0.75 mol／L KAc，pH＝4.2～4.6），混勻；將混勻后的溶液加入離心柱（質粒小提試劑盒DP103，北京天根生化科技有限公司）中，后面步驟參照質粒小提試劑盒說明書；最后用50μL TE溶液溶解DNA，－20 ℃貯存備用。

2.5 PCR 檢測和靈敏性分析

以上述3種方法提取的植物總DNA 為模板，進行PCR 檢測，引物引用謝艷等根據雙生病毒共同區及外殼蛋白基因保守序列設計的簡并引物PA 和PB，擴增片段大小為500bp。

PCR 檢測:PCR 反應體系按照TaKaRa的rTaq酶使用說明進行，反應程序為:94 ℃變性4min，35個循環的擴增（94 ℃30s，52 ℃20s，72 ℃30min），最后72 ℃延伸10min，8 ℃保存20h。

靈敏性分析:取2.4節中獲取的DNA 4μL，進行1、10、100、1 000、10 000 倍稀釋，然后按上述的PCR程序進行實驗，以檢測改進后的植物總DNA 提取方法的靈敏性。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色后BioRad凝膠成像系統觀察記錄。

2.6 Real Time PCR 反應

根據實驗室已測定的木爾坦棉花曲葉病毒DNAA 組分設計熒光定量引物，篩選得到擴增效率高、反應特異性強的一對引物 DLF／DLR（5′－CTGCCGAAGTTCAGACGCC－3′ 和 5′－CAGGATTATTCACCGGATACCCTA－3′），擴增片段大小為147 bp。上述3種方法提取的DNA 各取2μL，稀釋100倍后使用。根據SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa Code:DRR081）試劑盒操作說明配制反應液。用離心機快速離心含有反應液的PCR 反應管后，放入Eppendorf Realplex System 中，然后運行程序，采用兩步法進行Real Time PCR 反應。反應條件如下:預變性，95 ℃30s，95 ℃5s，60 ℃30s，40個循環。為了建立PCR 產物的熔解曲線，擴增反應結束后繼續從60 ℃緩慢加熱到95℃（每2s升高0.2 ℃）。

3 結果與分析

3.1 PCR 檢測結果

以上述3種方法提取的植物總DNA 為模板，進行PCR 檢測，引物引用謝艷等［7］設計的通用簡并引物PA 和PB，結果如圖1（a），均能擴增到預期的500bp大小的片段。說明3種方法均有效地抽提到雙生病毒的基因組核酸，改進的方法和另外兩種方法一樣可以應用。為了驗證改進方法的靈敏性，以改進后的方法提取的植物總DNA 為模板，依次稀釋1、10、100、1 000、10 000后進行PCR 擴增，擴增結果如圖1（b），在PCR 反應程序為35 個循環的條件下，模板稀釋1 000倍的情況下依然可以得到預期的片段，顯示改進的方法有較高的靈敏度。

圖1中M 為DNA 標記。圖1（a）中:1為陽性對照；2為陰性對照；3—5 為以CTAB 法提取植物的總DNA為模板進行的PCR擴增；6—8為以離心柱法提取植物的總DNA為模板進行的PCR擴增，9—11為改進后的方法提取的植物總DNA為模板進行的PCR擴增。圖1（b）中:1－5為以改進后的方法提取的植物總DNA為模板，依次稀釋1、10、100、、10 000后進行的PCR擴增。

圖1 PCR 檢測

3.2 Real Time PCR 反應結果

靈敏度分析只能定性地說明改進后的方法可行，有較高的靈敏度，但無法比較3種方法的優劣。為了比較3種方法提取雙生病毒基因組核酸的效率，采用熒光定量PCR 的方法進行分析，結果見圖2。從圖2中可知，對于雙生病毒基因組產率來說，3 種方法中CTAB法效率最低，離心柱法次之，改進方法最高。時間和價格比較見表1。從表1的數據來看，改進后的方法在價格和時間上也有一定優勢。

圖2 3種方法提取雙生病毒基因組核酸的效率比較

表1 3種方法提取雙生病毒基因組核酸的比較

4 討論

一些植物，如番茄、朱槿等，都富含多糖物質，從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質的植物中提取總DNA 的方法難度相對大于大多數的禾谷類及蔬菜類植物。從富含多糖的植物中提取DNA 時，由于多糖、單寧等物質與DNA 會結合成黏稠的膠狀物，不易分離，常導致總DNA 產量低、質量差、易降解等問題，影響了DNA 質量和純度，嚴重的甚至不能作為模板進行PCR 擴增。因此，一旦處理不好，對實驗檢測或鑒定結果影響較大。傳統的CTAB 法提取總DNA 時，為了獲得更多的病毒基因組，多采用增加實驗材料，先大量抽提、隨后濃縮的方法［14］，這樣對儀器和實驗時間的要求必然增加。植物總DNA 提取的離心柱法提取總DNA 的效果較好，但是處理每個樣品的價格較貴（7 元／樣品），因而每個樣品質量受限制（小于0.1g），最后得到的雙生病毒基因組量也有限。此外，植物總DNA 提取的離心柱法主要針對寄主的染色體DNA，而雙生病毒基因組是單鏈環狀的DNA，在大小和性質上都與寄主基因組DNA 有一定的差異，跟雙鏈環狀的質粒更接近，所以用該方法提取雙生病毒基因組可能會對其產率有一定的影響。考慮到以上兩個方面的因素，在傳統雙生病毒基因核酸提取方法的基礎上，結合總DNA 提取的CTAB 法和質粒提取的離心柱方法，發展了簡單快速的多糖植物雙生病毒基因組核酸的提取方法。從所得的數據來看，改進后的方法無論在靈敏度、時間、價格和產率上都具有一定的優勢，說明更適合于雙生病毒基因組核酸的提取和應用。

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