反膠束體系中脂肪酶催化乙酸甲酯與棉籽油合成生物柴油

左曉旭，李芳芳，龔春霞，高劍峰

（石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

反膠束是一種由表面活性劑（有時(shí)還需助表面活性劑）在含少量水的非極性溶劑中自發(fā)形成的透明或半透明的熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)［1-2］，其內(nèi)部可溶解水和其他水性分子，這些水性分子所形成的膜能將油水兩相分開(kāi)。高度分散的反膠束體系不僅為酶催化提供更大的相界面，且避免了酶和周圍有機(jī)相接觸，從而使酶保持較高活性［3］。利用酶法合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物易回收、無(wú)污染物排放等優(yōu)點(diǎn)［4-7］；但該方法也存在一些問(wèn)題：由于甲醇等短鏈醇對(duì)酶等蛋白質(zhì)有變性作用，因而過(guò)量的短鏈醇對(duì)酶催化反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用，使酶活性降低甚至失去活性。若用乙酸甲酯作為制備生物柴油的酰基受體，其自身不僅能和油脂完全混溶，且反應(yīng)副產(chǎn)物三乙酸甘油酯對(duì)脂肪酶也無(wú)毒害作用［8］。

采用固定化脂肪酶催化酯化和酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油已有很多報(bào)道［9-12］。 唐功等［13］研究了反膠束體系中的酶催化反應(yīng)，證明反膠束不僅可溶解酶，而且還可包埋細(xì)胞，從這個(gè)意義上講反膠束是一種新的生物催化劑固定化技術(shù)；他們還利用丁二酸二酯磺酸鈉（AOT）/正己烷反膠束體系催化合成己酸乙酯［14］。劉偉東等［15-16］在AOT/異辛烷反膠束體系中，以甲醇作為酰基受體，用Candida sp.99-125脂肪酶催化合成生物柴油，AOT反膠束體系為Candida sp.99-125脂肪酶催化大豆色拉油合成生物柴油提供了合適的微環(huán)境。Badenes等［17］在AOT/異辛烷反膠束體系中，用角質(zhì)酶催化甲醇和甘油三脂制備生物柴油，生物柴油收率超過(guò)75%。但在AOT/異辛烷反膠束體系中，用乙酸甲酯作為?；荏w來(lái)制備生物柴油尚未見(jiàn)報(bào)道。

本工作發(fā)揮新疆本地優(yōu)勢(shì)資源，以棉籽油為原料利用生物法合成生物柴油。用乙酸甲酯代替甲醇作為?；荏w，AOT反膠束作為酶的催化介質(zhì)，考察了反應(yīng)條件的影響以及脂肪酶的重復(fù)使用性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

棉籽油：新疆石河子市新安棉油有限責(zé)任公司；乙酸甲酯：分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；石油醚：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；脂肪酶（100～400 U/mg）、AOT（純度96%）、異辛烷（色譜純）及油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AOT反膠束體系的制備

按照一定的比例先后向50 mL三角瓶中加入60 mmol/L的AOT異辛烷溶液2.5 mL和溶有適量脂肪酶的緩沖溶液，在振蕩器上振蕩10 min，制成反膠束體系。

1.2.2 基本反應(yīng)體系

在上述反膠束體系中依次加入1 g棉籽油和382.3 μL乙酸甲酯，用保鮮膜封口，放入30 ℃搖床中振蕩反應(yīng)。改變反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣。將試樣用石油醚稀釋50倍，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后分析。

1.3 分析方法

采用Agilent公司7890A型氣相色譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜柱為HP-INNOHAA（30 m×0.32 mm×0.5 μm），F(xiàn)ID檢測(cè)。色譜柱升溫程序：初溫180 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至220 ℃保持3 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃，分流比30∶1，載氣為高純N2，進(jìn)樣量2 μL。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)試樣定性分析，確定產(chǎn)物中含有硬脂酸甲酯、棕櫚酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯4種脂肪酸甲酯；用外標(biāo)法定量分析脂肪酸甲酯的含量，并用式（1）計(jì)算脂肪酸甲酯的收率（Y）：

式中，ρ1為產(chǎn)物中脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，g/mL；ρ2為棉籽油完全甲酯化后脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，g/mL。

1.4 脂肪酶的重復(fù)使用

每一批次反應(yīng)結(jié)束后，取樣待測(cè)；然后直接向原體系中加入1 g棉籽油和適量充當(dāng)酰基受體的有機(jī)溶劑，進(jìn)行下一批次反應(yīng)；直至反應(yīng)后的脂肪酸甲酯收率降至40%以下，停止實(shí)驗(yàn)。第N批脂肪酸甲酯收率（YN）的計(jì)算方法見(jiàn)式（2）：

式中，N為反應(yīng)批次；YTN，YTN-1分別為第N批和第N-1批反應(yīng)結(jié)束時(shí)的總脂肪酸甲酯收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察了AOT濃度、水與AOT的質(zhì)量比（ζ0）、脂肪酶用量、緩沖溶液pH、乙酸甲酯與棉籽油的摩爾比（r）、反應(yīng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速等各種單因素對(duì)脂肪酶催化棉籽油與乙酸甲酯合成生物柴油反應(yīng)的影響。

2.1.1 AOT濃度的影響

表面活性劑的濃度關(guān)系到反膠束的形成和脂肪酶的催化活性。濃度太低，無(wú)法形成反膠束體系，而濃度太高，陰離子表面活性劑對(duì)脂肪酶有毒害作用，抑制酶的活性。AOT濃度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可看出，隨AOT濃度的增加，脂肪酸甲酯收率提高，當(dāng)AOT濃度為50 mmol/L時(shí)，脂肪酸甲酯收率達(dá)到最大值64.5%，即此濃度的表面活性劑既能維持反膠束體系的穩(wěn)定又能保持酶的催化活性；繼續(xù)增加AOT濃度，脂肪酸甲酯收率降低。因此，適宜的AOT濃度為50 mmol/L。

圖1 AOT濃度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.1 Effect of AOT concentration on the yield of fatty acid methyl ester（Y).

2.1.2 含水量的影響

在有機(jī)相中進(jìn)行的酶催化反應(yīng)，水的存在是維持脂肪酶催化活性的重要因素。對(duì)于反膠束體系，ζ0過(guò)小時(shí)，反膠束的水池尺寸較小，不能完全容納下酶分子，導(dǎo)致體系中的自由水大部分與表面活性劑結(jié)合，不夠維持脂肪酶活性構(gòu)象所需的自由水，從而使酶分子在有機(jī)溶劑中失活；ζ0太大時(shí)，酶分子雖能完全增溶于反膠束水池內(nèi)，但反膠束的穩(wěn)定性下降。ζ0對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可看出，當(dāng)ζ0=3～5時(shí)，隨ζ0的增加，脂肪酸甲酯收率下降；ζ0繼續(xù)增至7時(shí)，脂肪酸甲酯收率提高到最大值62.5%；當(dāng)ζ0＞7后，隨ζ0的增加，脂肪酸甲酯收率逐漸降低。因此，適宜的ζ0=7。

圖2 ζ0對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.2 Effect of ζ0 on Y.

2.1.3 脂肪酶用量的影響

在反膠束體系中，脂肪酶應(yīng)完全包容在反膠束水池中。在一定范圍內(nèi)增加脂肪酶用量，可提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率；但當(dāng)達(dá)到一定用量后，由于酶促界面的限制，轉(zhuǎn)化率不再提高。因此在反應(yīng)體系中維持合適的脂肪酶用量非常重要。脂肪酶用量對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可看出，脂肪酸甲酯收率隨脂肪酶用量的增加而提高，當(dāng)脂肪酶用量為15 mg（溶液體積為2.5 mL，下同）時(shí)，脂肪酸甲酯收率達(dá)到最大值59.6%；繼續(xù)增加脂肪酶用量，脂肪酸甲酯收率反而有所下降。因此，脂肪酶用量為15 mg較為適宜。

圖3 脂肪酶用量對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.3 Effect of lipase dosage on Y.

2.1.4 緩沖溶液pH的影響

緩沖溶液pH決定脂肪酶分子和反膠束膜所帶電荷的種類，它不僅決定酶的活性構(gòu)象及其在反膠束體系中的溶解能力，而且其變化也可能引起酶分子與反膠束膜之間相互作用的改變，從而多方面地影響酶的催化活力［18］。緩沖溶液pH對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 緩沖溶液pH對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.4 Effect of buffer pH on Y.

由圖4可看出，隨緩沖溶液pH的增大，脂肪酸甲酯收率緩慢提高，緩沖溶液pH=7時(shí)達(dá)到最大值63.6%；隨后脂肪酸甲酯收率隨緩沖溶液pH的增大而降低。因此，緩沖溶液pH=7較適宜。

2.1.5 底物配比的影響

底物濃度過(guò)高會(huì)對(duì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)生底物抑制現(xiàn)象，抑制酶的活性；而底物濃度過(guò)低又無(wú)法使反應(yīng)向正方向進(jìn)行。r對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可看出，隨r的增大，脂肪酸甲酯收率提高，當(dāng)r增至4時(shí)，脂肪酸甲酯收率達(dá)到最大值63.5%；但當(dāng)r＞4后，脂肪酸甲酯收率降低。因此，r=4較適宜。

圖5 r對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.5 Effect of r on Y.

2.1.6 反應(yīng)溫度的影響

在反膠束體系中控制一定的溫度范圍，既能提高脂肪酶的活性，又能維持反膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on Y.

由圖6可看出，在一定范圍內(nèi)，隨反應(yīng)溫度的升高，脂肪酸甲酯收率提高，當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)達(dá)到最大值62.1%，這可能是由于反應(yīng)溫度的升高增加了乙酸甲酯在水中的溶解度，加快了反應(yīng)速率；當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，脂肪酸甲酯收率降低，這可能是由于反應(yīng)溫度升高一方面使反膠束結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，另一方面改變了酶的活性構(gòu)象，使其活性降低。因此，最佳的反應(yīng)溫度為40 ℃。

2.1.7 搖床轉(zhuǎn)速的影響

對(duì)于反膠束體系中的酶催化反應(yīng)，搖床轉(zhuǎn)速影響反應(yīng)的傳質(zhì)和傳熱，同時(shí)也影響反膠束結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此控制合適的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)脂肪酶的活性有重要的影響。搖床轉(zhuǎn)速對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖7。由圖7可看出，隨搖床轉(zhuǎn)速的增大，脂肪酸甲酯收率逐漸升高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，脂肪酸甲酯收率達(dá)到最大值63.8%；但隨搖床轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增大，脂肪酸甲酯收率不斷降低。這可能是由于搖床轉(zhuǎn)速升高導(dǎo)致膠束之間的碰撞幾率增加，反膠束之間重新并合和形成，使得部分脂肪酶在有機(jī)溶劑中失活。因此，搖床速度設(shè)置在140 r/min較適宜。

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響Fig.7 Effect of rotating speed on Y.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了7因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析見(jiàn)表2。

由表2可知，在反膠束體系下脂肪酶催化棉籽油與乙酸甲酯合成生物柴油的影響因素大小依次為：緩沖溶液pH＞反應(yīng)溫度＞r＞脂肪酶用量＞AOT濃度＞搖床轉(zhuǎn)速＞ζ0；優(yōu)化的反應(yīng)條件為：緩沖溶液pH=7，反應(yīng)溫度35 ℃，r=3，脂肪酶用量10 mg，AOT濃度40 mmol/L，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，ζ0=7。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

表2 正交實(shí)驗(yàn)極差分析Table 2 Range analysis of the orthogonal experiments

2.3 脂肪酶的重復(fù)使用性能

在反膠束體系中利用3種?；荏w（甲醇、碳酸二甲酯、乙酸甲酯）與棉籽油催化合成生物柴油，所得脂肪酸甲酯收率最高分別可達(dá)73.4%，66.2%，65.53%。由此可知，不同的酰基受體得到的脂肪酸甲酯收率不同。在此基礎(chǔ)上，探索了在反膠束體系中脂肪酶催化3種?；荏w與棉籽油合成生物柴油反應(yīng)中脂肪酶的重復(fù)使用性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可看出，在用反應(yīng)產(chǎn)物作為溶劑、不改變反應(yīng)體系和反應(yīng)環(huán)境的情況下，使用甲醇時(shí)脂肪酶的活性能維持3個(gè)批次，在第3個(gè)批次后脂肪酸甲酯收率明顯下降；使用碳酸二甲酯時(shí)脂肪酶的活性能維持4個(gè)批次，在第4個(gè)批次后脂肪酸甲酯收率雖有所下降，但下降速率比使用甲醇時(shí)趨緩；使用乙酸甲酯時(shí)脂肪酶的活性能維持7個(gè)批次，在第7個(gè)批次后脂肪酸甲酯收率的下降趨勢(shì)仍不明顯，說(shuō)明乙酸甲酯作為?；荏w時(shí)，乙酸甲酯及其反應(yīng)副產(chǎn)物三乙酸甘油酯對(duì)脂肪酶均無(wú)毒害作用，且對(duì)脂肪酶的活性也無(wú)明顯負(fù)面影響，很大程度上提高了脂肪酶的穩(wěn)定性。相比于甲醇和碳酸二甲酯，乙酸甲酯作為?；荏w時(shí)的脂肪酸甲酯收率雖不高，但它對(duì)脂肪酶的穩(wěn)定性和活性的提高具有明顯的優(yōu)勢(shì)。今后需進(jìn)一步尋求提高乙酸甲酯作為酰基受體時(shí)脂肪酸收率的方法，為生物柴油的生產(chǎn)開(kāi)拓新的途徑。

圖8 使用3種?；荏w時(shí)脂肪酶的反應(yīng)批次Fig.8 Enzymatic reactions with three acyl receptors.

3 結(jié)論

1）反膠束體系下脂肪酶催化棉籽油與乙酸甲酯合成生物柴油的影響因素大小依次為：緩沖溶液pH＞反應(yīng)溫度＞r＞脂肪酶用量＞AOT濃度＞搖床轉(zhuǎn)速＞ζ0；優(yōu)化的反應(yīng)條件為：緩沖溶液pH=7，反應(yīng)溫度35 ℃，r=3，脂肪酶用量10 mg，AOT濃度40 mmol/L，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min， ζ0=7。在此反應(yīng)條件下，脂肪酸甲酯收率最高可達(dá)65.53%。

2）與甲醇和碳酸二甲酯相比，在反膠束體系下，乙酸甲酯作為?；荏w與棉籽油合成生物柴油對(duì)提高脂肪酶的穩(wěn)定性具有顯著的作用。

3）在反膠束體系中合成生物柴油，使用的是游離脂肪酶，而不必使用固定化脂肪酶，從而大幅降低了成本。表明AOT反膠束體系為脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油提供了合適的微環(huán)境。今后還需對(duì)反膠束體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行更深入的研究，以尋求進(jìn)一步提高脂肪酸甲酯收率的方法。

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