硝基苯和間苯二酚對3種海洋微藻的毒理效應

王洪斌, 花文鳳, 李信書, 李士虎, 閻斌倫

(1. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室, 江蘇 連云港 222005)

藻類作為海洋和內陸水體中重要的初級生產者, 在整個生態系統中有著舉足輕重的地位。微藻具有很重要的生態價值[1-2], 微藻在海洋生物中約占40.86%, 其比重非常之大。微藻中固定碳的量約占全球有機物中的50%[3]。同時很多天然的產品都來源于微藻[4]。近年來, 化工廢水污染越來越嚴重, 已經威脅到人類的生存環境, 化學物質通過各種途徑污染水體, 第一個受害者就是藻類生物。從環境學角度來看, 研究化學物質對藻類的毒理效應至關重要。自從20世紀60年代以來, 國外許多學者在這方面進行了大量的工作, 積累了豐富的資料, 并取得了較為滿意的結果。在水環境中, 藻類一旦富集化學物質, 便進入食物鏈, 經過生物逐級放大, 將危及水生動物和人類的健康。

本文以塔瑪亞歷山大藻、海鏈藻和綠色巴夫藻作為供試藻種, 通過2種不同濃度的化學試劑對3種海洋微藻的生長及葉綠素a合成的影響, 研究其對微藻的毒理效應, 旨在提示化學物質污染對水體危害的嚴重性, 揭示海洋微藻凈化廢水的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、海鏈藻(Thalassiosira weissflogii)、綠色巴夫藻(Pavlova viridis)均為淮海工學院海洋學院海藻實驗室保存種。海水培養液采用f/2 加富海水, 微藻培養所用海水采自連云港高公島海域(鹽度約31.00～32.00)漲潮時, 醋酸纖維薄膜過濾, 在121℃下20 min滅菌待用。

硝基苯溶液: 取0.025mL硝基苯于100mL燒杯中, 加適量蒸餾水溶解, 轉至100mL容量瓶, 定容至100mL, 然后移至250mL錐形瓶備用。

間苯二酚溶液: 稱取0.03g間苯二酚于100mL燒杯中, 加適量蒸餾水溶解, 轉至100mL容量瓶, 定容至100mL, 然后移至250mL錐形瓶備用。

1.2 方法

1.2.1 微藻培養方法

藻種在 f/2 培養液中培養到指數生長期接種物。微藻不通氣靜止培養, 采用f/2海水培養液, 在無菌條件下將20 mL處于對數期的藻種接種于裝有180 mL f/2培養液的500 mL的錐形瓶中, 光照度為3000 lx, 明暗周期12 h /12 h, 每日定時搖動3次, (23 ±1)℃下培養[5]。

1.2.2 微藻生長測定

取培養至第4d的藻液200 mL, 分別加入0mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL已配好的硝基苯溶液, 使硝基苯質量濃度分別為0、1.5、3、6、12mg/L 5個梯度, 間苯二酚實驗同硝基苯, 采用吸光度法定時對其生長進行測定。每個實驗設3個平行組。

吸光度的測定: 以接種時刻為初始時間開始測定, 每天取出5 mL 藻液。以蒸餾水為空白對照, 分別在680 nm波長下測定每種藻A值。連續7d。

比生長速率計算:K= (lnNt－lnN0)/T。其中K為比生長速率,N0為藻液起始濃度,Nt為培養t時間后的藻液濃度,T為培養時間(h)。

1.2.3 微藻葉綠素a含量測定

采用熱乙醇萃取分光光度法[6]取10mL培養至20d的共培養藻液, 5℃、6000r/min離心5min, 棄上清液, 取沉淀-20℃下冷凍12h。取出后迅速用9mL 95%乙醇(80℃預熱)于80℃熱水浴萃取2min, 超聲波清洗儀超聲振蕩處理10min, 于4℃黑暗靜置6h后, 5℃、6000r/min離心5min, 取上清, 用分光光度計于波長665nm和750nm分別測定A值, 加入1mol/L鹽酸酸化, 于波長665nm和750nm處再分別測定A值, 按下列公式計算葉綠素含量。

式中, Chla乙醉為乙醇法測定的葉綠素a質量濃度(μg/L);E665為乙醇萃取液于波長665nm的吸光值;E750為乙醇萃取液于波長750nm的吸光值;A665為乙醇萃取液酸化后于波長665nm的吸光值;A750為乙醇萃取液酸化后于波長750nm的吸光值;V乙醇為乙醇萃取液的體積(mL);V藻樣為藻樣的體積(L)。

2 結果與分析

2.1 硝基苯對3種海洋微藻生長量的影響

2.1.1 塔瑪亞歷山大藻( A. tamarense )

低質量濃度的硝基苯對A. tamarense抑制作用不明顯, 隨著培養時間的延長,A. tamarense的生長量雖然都在增長, 但硝基苯質量濃度越高,A. tamarense的比生長速率越小。對照組生長最好, 在硝基苯質量濃度為12mg/L時抑制現象最為明顯, 與對照組比較, 抑制率達22.3%, 這與杜慶才等[7]和沈洛夫等[8]的研究結論一致。結果見圖1。

圖1 不同質量濃度硝基苯對A. tamarense生長量的影響 Fig. 1 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of A. tamarense

2.1.2 海鏈藻(T. weissflogii)

隨著培養時間的增加, 不同質量濃度的硝基苯條件下,T. weissflogii的生長量有一個先降后升的趨勢, 這可能是微藻對硝基苯有一個短暫的適應期。整體來看, 硝基苯對T. weissflogii的抑制現象不及另外2種藻明顯, 從其生長曲線圖(圖2)可以看出, 它反而有一定的促進作用, 這與杜慶才等[7]的研究結論不一致, 可能由于海洋微藻得的種屬差異對硝基苯 的毒性作用產生差異, 尚有待進一步研究。硝基苯質量濃度的增大對T. weissflogii的比生長速率影響不明顯, 由圖2可以看出, 對照組及1.5mg/L組在第7天時生長量最低, 其他3組均高于對照組水平。

圖2 不同質量濃度硝基苯對T. weissflogii生長量的影響 Fig. 2 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of T. weissflogii

2.1.3 綠色巴夫藻(P. viridis)

由圖3可知, 對照組生長最好, 硝基苯的添加對P. viridis的生長有抑制作用,隨著硝基苯質量濃度的增大, 對P. viridis的生長量抑制越明顯。硝基苯質量濃度為12mg/L時, 抑制率相對于對照組達到了20.04%, 在其他質量濃度下, 相對于對照組的抑制率都在9%左右。所以, 對于P. viridis, 硝基苯抑制作用呈現劑量效應。

圖3 不同質量濃度硝基苯對P. viridis生長量的影響 Fig. 3 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of P. viridis

2.2 間苯二酚對3種海洋微藻生長量的影響

2.2.1 塔瑪亞歷山大藻( A. tamarense )

加間苯二酚后,A. tamarense的生長并沒有和預計的一樣受到明顯抑制, 反而是添加一定量的間苯二酚, 其生長更好, 不同質量濃度的間苯二酚對其均有一定的促進作用, 且在間苯二酚質量濃度為3mg/L時,A. tamarense的生長量高于對照組13.26%。此結論與許文武等[9]有差異, 是否說明A. tamarense在生長代謝過程中能利用間苯二酚有待證實, 但揭示了海洋微藻在處理化工廢水方面有潛在的應用前景。由圖4可知, 在質量濃度為3mg/L時, 第7天生長量達到了最高, 高于對照組13.26%, 間苯二酚質量濃度高于3mg/L時, 它的促進率又有所下降。

2.2.2 海鏈藻(T. weissflogii)

由圖5可知, 除個別數據外, 隨著間苯二酚質量濃度的增加,T. weissflogii的生長量整體受到抑制, 質量濃度越大, 抑制現象越明顯。間苯二酚的質量濃度為12mg/L時, 第7天時生長量相對于對照組的抑制率最大, 生長量只有對照組的73.9%。

圖4 不同質量濃度間苯二酚對A. tamarense生長量的影響 Fig. 4 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of A. tamarense

圖5 不同質量濃度間苯二酚對T. weissflogii生長量的影響 Fig. 5 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of T. weissflogii

2.2.3 綠色巴夫藻(P. viridis)

由圖6可知, 對照組如預期的一樣生長的最好, 隨著間苯二酚質量濃度的增加,P. viridis的生長量相對于對照組的抑制率逐漸增大, 當間苯二酚的質量濃度為6mg/L時, 生長量是對照組的76.4%, 相對于其他實驗組抑制率最大。

2.3 硝基苯對3種海洋微藻葉綠素a的影響

加硝基苯的實驗組相對于對照組,A. tamarense葉綠素 a的含量均有下降趨勢, 波動較大, 在3mg/L實驗組, 葉綠素a含量最低, 僅為對照組的68.6%, 1.5mg/L實驗組葉綠素a的含量相對最高, 為對照組的89.7%; 硝基苯對T. weissflogii葉綠素a的抑制現象不明顯, 而在6mg/L實驗組, 還促進了T. weissflogii葉綠素a含量增長, 高出對照組的0.7%, 在硝基苯質量濃度為12mg/L時, 葉綠素a含量受到抑制, 為對照組的89.17%, 與上述的生長量實驗結論是一致的;P. viridis所有實驗組中, 葉綠素a含量均小于對照組, 也就是說硝基苯對P. viridis葉綠素a 起到了抑制作用, 在12mg/L時, 抑制率最大, 葉綠素a的含量達到最低, 僅為對照組的41%。硝基苯對3種海洋微藻葉綠素a含量的影響(圖7)主要表現在降低葉綠素a 的合成量, 其中對A. tamarense和P. viridis葉綠素a含量的影響呈現一定的劑量效應, 而對于T. weissflogii, 硝基苯對其葉綠素a的影響波動不大, 結論與相關文獻報道不一致, 有待深入研究。

圖6 不同質量濃度間苯二酚對巴夫藻生長量的影響 Fig. 6 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of P. viridis

圖7 不同質量濃度硝基苯對3種微藻葉綠素a含量的影響 Fig. 7 Effect of different concentration of nitrobenzene on the content of Chlorophyll a of 3 marine microalgae

2.4 間苯二酚對三種海洋微藻葉綠素a的影響

由圖 8可知, 加間苯二酚后, 各實驗組A. tamarense的葉綠素a含量均小于對照組, 但影響不明顯, 6mg/L組與12mg/L組的葉綠素a的含量分別為對照組的90.14%、92%, 與上述生長量結論一致。間苯二酚對T. weissflogii葉綠素a含量的影響隨質量濃度的增大而增大, 與對照組相比,T. weissflogii各實驗組葉綠素a含量均有所下降, 6mg/L組與12mg/L組的葉綠素a的含量分別為對照組的58%、52%。相比較A. tamarense和T. weissflogii, 間苯二酚對P. viridis葉綠素a的影響更明顯, 隨著間苯二酚質量濃度的增加, 葉綠素a的含量在逐漸下降, 且在質量濃度為12mg/L時, 葉綠素a含量最低, 僅為對照組的1.1%。

3 結論

不同質量濃度的2種化學物質對供試的3種海洋微藻的生長均有一定程度的影響。其中硝基苯對A. tamarense和P. viridis的生長抑制作用隨硝基苯質量濃度的增加抑制越明顯。硝基苯對T. Weissflogii生長有一定的促進作用。間苯二酚對T. weissflogii和P. viridis的生長抑制作用隨間苯二酚質量濃度的增加抑制越明顯。而對于A. tamarense, 不同質量濃度的間苯二酚對其生長均有一定的促進作用。

圖8 不同質量濃度間苯二酚對3種微藻葉綠素a含量的影響 Fig. 8 Effect of different concentration of resorcinol on the content of Chlorophyll a of 3 marine microalgae

硝基苯對A. Tamarense和P. Viridis葉綠素a含量的影響呈現一定的劑量效應, 對T. Weissflogii葉綠素a的影響不大; 間苯二酚對3種海洋微藻葉綠素a 含量影響程度有所差異, 其中對A. tamarense影響極不明顯。

T. Weissflogii和A. tamarense在含硝基苯和間苯二酚組分的化工廢水處理方面具有一定的潛在應用價值。

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