白斑綜合征病毒對脊尾白蝦的致病性研究

沈 輝 , 萬夕和 王李寶 費榮梅, 李 淑, 柏 玲, 凌 云 黎 慧 高 波

(1. 江蘇省海洋水產研究所, 江蘇 南通 226007; 2. 上海海洋大學, 上海 201306; 3. 南京農業大學, 江蘇 南京 210095)

自20世紀90年代以來, 白斑綜合征病毒給全球對蝦養殖業造成了巨大的經濟損失[1]。在已報道的研究中, 該病毒可感染并致死多個對蝦種類, 如中國對蝦(Penaeus chinensis)[2-4]、南美白對蝦(Penaeus vannamei)[5]、斑節對蝦(Penaeus mondom)[6-8]等一些重要對蝦經濟養殖品種。

脊尾白蝦又稱小白蝦, 是中國特有的經濟蝦類之一[9]。近年來, 由于味道鮮美, 養殖效益較高, 脊尾白蝦的養殖規模面積迅速擴大。但隨著養殖密度的不斷增大, 其病害問題開始日益凸顯。目前, 對脊尾白蝦的研究報導主要集中在生物學[10]及繁殖育種學[11]方面, 而脊尾白蝦疾病的研究工作相對較少, 吳友呂等[12]通過電子顯微鏡的觀察發現浙江發病的脊尾白蝦體內存在一種桿狀病毒, 雷質文[13]等在對WSSV進行研究時認為脊尾白蝦是WSSV的宿主之一。2010年、2011年江蘇沿海多數地方海水養殖中發生了脊尾白蝦大規模死亡的現象, 本課題組通過對大量發病樣品進行病毒檢測分析發現, 發病樣品中白斑綜合征病毒感染率為100%。另外, 通過感染試驗, 進一步研究了白斑綜合征病毒對脊尾白蝦的感染特性和致病性。

1 材料與方法

1.1 發病蝦的分析

發病脊尾白蝦取自江蘇南通東凌養殖場、江蘇大豐裕華灘養殖場等。取10只發病蝦的鰓絲、肝 胰臟、肌肉、腸道等組織器官, 提取DNA或RNA模板后進行WSSV、桃拉病毒(TSV)及傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的檢測, 采用的引物序列見表1。

表1 對蝦病毒檢測引物及檢測結果 Tab. 1 The primers for testing virus in shrimp and the test results

1.2 WSSV對脊尾白蝦的感染試驗

1.2.1 實驗條件

實驗在江蘇省海水增養殖技術及種苗中心進行。實驗用海水為天然海水, 海水相對比重為1.021, pH為 7.8～8.3, 海水經沙濾及暗沉淀后備用, 實驗用小水泥池容積為2 m3, 24 h充氣, 每天換水1次, 換水量為80%。

1.2.2 實驗用蝦

發病蝦: 2011年8月在江蘇南通東凌養殖場發病池塘采取, 部分病蝦個體現場取其鰓、肝胰臟、腸道等組織器官固定, 部分樣品放干冰帶回實驗室-70℃感染實驗及鑒定備用。

健康蝦: 2011年9月在江蘇省海洋水產研究所繁殖育種基地采取, 選擇體表干凈, 活力強, 體長(5±0.5)cm, 體質量(2.3±0.3)g, 肢體健全個體進行WSSV、TSV及IHHNV的檢測, 檢測結果為陰性樣品作為感染實驗用蝦。

1.2.3 人工注射感染

病毒粗提液的制備按謝數濤[14]等的方法并進行部分調整后對病蝦體內WSSV進行粗提。取體表發紅、顯微觀察甲殼帶有白斑且PCR擴增為陽性的瀕死病蝦, 在冰浴下剪碎, 按0.1 g組織加入1 mL TN緩沖液(pH 7.4), 于勻漿器中勻漿, 將勻漿液以3 500 r/min離心15 min, 棄沉淀, 將上清液經0.45 μm孔徑濾膜過濾, 過濾后液體即為病毒粗提液。

取健康蝦進行試驗分組, 分別為空白組、注射生理鹽水組、注射病毒液組, 各組設立平行A組和B組, 注射劑量為0.2 mL。每個小水泥池養殖100尾脊尾白蝦進行觀察實驗。每天監測各組蝦的生理狀態, 并記錄各組死亡個數, 并收集瀕死蝦固定后, 進行超微細胞病理觀察。另外, 每天取對照組、注射生理鹽水組及注射病毒液組5只死亡蝦(未死亡或死亡不足5只時取同樣設置組補足數量)進行WSSV的病毒檢測, 檢測方法同上。

2 結果

2.1 脊尾白蝦發病特征

江蘇南通東凌海水養殖場以及大豐裕華灘海水養殖場于2011年8月和2011年9月分別發生了脊尾白蝦大量死亡現象。發病蝦(圖1)表現為反應遲鈍, 沿池塘四周慢慢游動; 攝食量減少, 甚至不攝食。蝦體發紅, 胃腸空虛(圖1-1), 甲殼易于剝落, 甲殼部白斑肉眼觀察不明顯, 對頭胸甲及尾部甲殼顯微觀察可見明顯白斑(圖1-2)。

圖1 發病脊尾白蝦 Fig.1 The infected shrimp

2.2 發病蝦WSSV、TSV、IHHNV等相關病原檢測結果

應用分子生物學手段對3種常見蝦類病毒進行了檢測, 結果發現, 所有的樣品中, WSSV的檢測率為100%, 而TSV和IHHNV檢出率都為0, 詳細結果見表1。在WSSV檢測過程中, 雖然有20%的樣品僅第一對引物檢測為陰性, 但第二對引物檢測表現為陽性, 此類樣品的WSSV檢測結果仍應判為陽性。

2.3 WSSV對脊尾白蝦的致病性

感染實驗進行過程中, 注射病毒粗提液組在感染實驗進行第2天后就出現攝食量減少, 部分蝦離群在水面上獨游, 游動時失去平衡, 部分蝦長臥池底對外界刺激反應減弱。感染實驗第3天, 注射病毒組部分蝦失去攝食行為, 身體發紅, 游動靠邊, 注射生理鹽水組也有個別死亡。在第4天注射病毒組出現了死亡, 隨后死亡個數逐漸增加, 死亡高峰出現在第8天, 14 d后注射病毒組感染實驗總累積死亡率達到68.5%, 死亡個體表現為游動緩慢, 不攝食, 通體微紅, 頭胸甲部在顯微觀察下有白色斑點。

應用分子生物學方法對感染后的發病個體以及死亡個體都進行了檢測, 結果發現, 所有的發病及死亡個體蝦都能檢出WSSV。

表2 脊尾白蝦人工感染病毒死亡統計及病毒檢測結果 Tab. 2 The mortality of artificial infected Exopalaemon carinicauda Holehuis and virus test results

2.4 病毒電鏡觀察

對健康蝦、發病蝦及感染蝦的鰓、肝胰臟及腸道組織器官細胞切片觀察發現, 健康蝦的細胞核形態正常, 核膜與核孔結構清晰, 線粒體、內質網及微管等器官形態正常, 未見明顯的病毒粒子和其他病原(圖2-1)。在發病蝦與感染實驗病蝦的各組織器官的細胞核出現腫脹, 染色質消失(圖2-2); 線粒體變圓, 內嵴消失, 甚至出現空泡化等一系列的細胞病理變化(圖2-2, 2-3)。另外, 在各組織器官的細胞核與細胞質中都發現了大量的桿狀病毒, 病毒粒子大小約為(130～170)nm×(305～405)nm; 核衣殼呈子彈形, 一端較細而一端較粗, 完整病毒粒子由核心、衣殼和囊膜構成, 核心與核衣殼結合緊密, 囊膜為單位單層膜結構(圖2-2, 2-3, 2-4)。

3 討論

3.1 WSSV的致病性

圖2 WSSV感染下引起的細胞超微結構變化 Fig. 2 Changes of Exopalaemon carinicauda Holehuis cell ultrastructure induced by WSSV infection

作者通過對發病蝦及其感染蝦的體表癥狀、細胞病理、病毒分子生物學檢測及病毒感染實驗進行了WSSV對脊尾白蝦的感染及致病性研究。首先, 體表癥狀表明, 池塘發病蝦與感染蝦死亡癥狀基本一致。其次, 在感染實驗中, 將病毒粗提液最后通過濾膜過濾, 以避免其他病原因素, 如弧菌[18-19]、寄生 蟲[20]等因素的影響, 結果顯示, 感染蝦出現了大量的死亡, 14 d累積死亡率達68.5%, 表明WSSV對脊尾白蝦具有較強的致病性。再次, 對實驗蝦病毒分子 生物學檢測發現, 發病蝦及感染蝦WSSV為陽性, TSV及IHHNV未檢出, 由此可以排除其他兩種病毒的可能性。最后, 對發病蝦、健康蝦及感染蝦的細胞超微觀察后, 發現WSSV健康蝦的細胞形態正常, 在各組織器官的細胞質中未見WSSV粒子, 而發病蝦與感染蝦都出現了明顯的病理變化, 且細胞病理變化相似, 在各組織器官的細胞質中還發現了大量的成熟或裝配的WSSV粒子。以上實驗結果符合柯赫氏法則, 作者認為, WSSV感染脊尾白蝦并可以導致大規模的死亡。

3.2 脊尾白蝦感染WSSV的特征與死亡率

WSSV感染甲殼類動物基本都會引起甲殼表皮細胞、鰓上皮細胞的組織器官壞死, 進而在寄主甲殼部分產生肉眼可見白色斑點, 如中國對蝦[2]、斑節對蝦[6]及克氏原螯蝦(Cambarus proclarkii)[21]發病時甲殼帶有的明顯白斑。脊尾白斑感染WSSV死亡時身體發紅, 甲殼部白色斑點肉眼不可見, 但剝離后在光鏡下可見, 這與斑節對蝦[7]的死亡特征有些類似, 正因為無明顯白點和體表發紅, 則很容易與TSV的感染[16]特征相混淆。WSSV對大部分蝦類都是強致病性病毒, 據相關流行病學的研究報道, 該病毒可引起中國對蝦、南美白對蝦及斑節對蝦等蝦類80%以上的死亡率, 在實驗條件下會更高。在作者的感染實驗中脊尾白蝦死亡率為68.5%, 而在野外自然池塘養殖條件下死亡率僅在30%～40%, 死亡率明顯低于其他經濟養殖蝦類。另外, WSSV感染并引起脊尾白蝦的死亡周期與其他蝦類也有所不同。據WSSV流行病學研究報道, WSSV引起蝦類的死亡一般在夏末秋初, 因池塘理化因子如溫度[22]、溶解氧[23]、鹽度[24]的劇變及多種病原因子如弧菌與病毒的共同作用毒力加倍下[25], 死亡率達到高峰。但作者對脊尾白蝦流行病學調查后發現, 除夏末秋初的死亡高峰期外, 從春季開始就有零星死亡, 且進入秋末冬初氣溫較低時, 部分養殖池塘仍出現較高的死亡率。分析原因, 作者認為, 這與脊尾白蝦的苗種獲取方式有關, 脊尾白蝦為抱卵孵化蝦類, 目前苗種以種蝦留池自繁的方式為主, 因此初步推斷WSSV長期感染是因為病毒的垂直傳播, 其傳播機制正在研究中。

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