適用于條斑紫菜的雙向電泳樣品制備方法

趙宇鵬, 周 偉, 趙佩佩, 才金玲, 朱大玲, 潘光華, 劉洪艷, 王廣策

(1. 天津科技大學 海洋科學與工程學院, 天津 300457; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

紫菜(Porphyra)是一類原始紅藻, 屬于紅藻門(Rhodophyta)原紅藻綱(Rhodophyceae)紅毛菜亞綱(Bangiophycidae)紅毛菜目(Bangiales)紅毛菜科(Bangiaceae)紫菜屬(Porphyra)[1]。目前中國的栽培物種包括長江以南的壇紫菜(Porphyra haitanensis)和長江以北的條斑紫菜(Porphyra yezoensis), 其中條斑紫菜的產值最高。條斑紫菜是一種高蛋白、低脂肪的營養豐富的海藻, 富含人體所需的維生素和微量元素, 既可食用、藥用又可作為加工業的重要原料, 還可以用于水環境監測和治理, 因此對于紫菜的研究具有非常高的應用價值, 對于條斑紫菜蛋白組成的了解有助于分析其營養成分等方面的品質, 對生產應用具有指導作用[2]。

蛋白質組學是以細胞內存在的全部蛋白質及其活動規律為研究對象, 它是繼基因組學之后在分子水平上了解生命過程邏輯性的第二步, 是后基因組時代生命科學研究和核心內容之一。早在蛋白質組概念提出來之前的1975年, 二維凝膠電泳技術經過長期發展, 和質譜技術、生物信息學成為蛋白質組學研究的三大核心技術[3]。雙向電泳是研究蛋白質表達最有效的工具, 是一種同時對上千種蛋白質進行分離的高分辨率的方法[4]。近年來雙向電泳技術在植物應用中有不少報道, 但大部分集中在一些高等模式生物上, 對于條斑紫菜的應用還沒見報道, 條斑紫菜富含色素、多酚、多糖等次生代謝產物, 其蛋白樣品制備相對于其他植物更加困難。作者比較了硫酸銨沉淀法、丙酮—TCA法和酚提取方法等幾種方法, 對條斑紫菜葉狀體總蛋白的提取效果, 發現酚提取法能更好地提取蛋白,更高效地除去樣品的鹽離子及其他干擾雜質, 適用于組織復雜的植物[5-7], 并在此方法基礎上進行了改進。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

條斑紫菜葉狀體采自江蘇南通栽培海區, 取回實驗室后用消毒海水洗凈, 陰干, 凍存于-80℃待用。

1.2 試劑與儀器

二維電泳系統、掃描儀、固化IPG干膠條pH 3～10線性17 cm、IPG(Immobilized pH gradients)緩沖液、IPG覆蓋油、兩性電解質購自美國Bio-Rad公司; 過硫酸銨、硫脲、CHAPS、PMSF、考馬斯亮藍 G-250、溴酚藍等購自Amersha Pharmacia公司。尿素、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、碘乙酰胺、DTT、SDS、PVP、TEMED、β-巰基乙醇均購自美國 Sigma 公司。蛋白酶抑制劑、瓊脂糖、蛋白 Marker、低分子量標準蛋白質、牛血清蛋白(BSA)購自北京鼎國生物技術公司。三氯乙酸、平衡飽和酚丙酮、乙醇等其他所用藥品或試劑為國產分析純級。

1.3 蛋白質提取方法

-80℃凍存葉狀體材料稱質量, 放入預冷的研缽中, 加入少量石英砂(二氧化硅), 加入10% PVPP[8], 研磨成粉末, 一直加入液氮保證組織不解凍(不溶的PVPP可以有效吸附酚類化合物)。

1.3.1 飽和硫酸銨沉淀法

(1) 研磨好的材料粉末加入2倍體積預冷的蛋白提取液(8 mol/L 尿素, 0.1 mol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 抗壞血酸, 1% β-巰基乙醇, 0.5 mmol/L PMSF, pH7.8), 混勻后于4℃放置過夜。

(2) 離心10 000 r/min, 20 min, 4℃, 去沉淀, 緩慢加入硫酸銨(冰浴)至飽和, 再次4℃過夜; 離心10 000 r/min, 20 min, 4℃, 取沉淀。

(3) 沉淀用裂解液(8 mol/L尿素, 4% CHAPS, 60 mmol/L DTT, 40 mmol/L Tris-HCl, pH8.8)重懸后離心10 000 r/min, 20 min, 4℃, 去除不溶物。上清用超濾管反復除鹽, 得到濃縮的蛋白。

1.3.2 三氯乙酸/丙酮沉淀法[9]

(1) 研磨好的材料粉末加入蛋白提取液(10%的三氯乙酸, 即10 g三氯乙酸溶解在100 mL丙酮中, 加70 μL?-巰基乙醇或DTT),-20℃過夜, 期間搖2～3次, 蛋白質會形成白色沉淀。

(2) 10 000g, 4℃離心30 min, 用槍頭小心吸取上清丟棄, 加0.07%?-巰基乙醇于丙酮溶液中, 懸浮沉淀, 放-20℃約1 h, 期間搖1～2次。

(3) 重復步驟2 2～3次, 取沉淀-20℃ 低溫晾干, 約4～5 h, 打開離心管蓋子。

(4) 取出蛋白干粉, 加0.1 mol/L NaOH[10]溶液, 1 min, 加入蛋白裂解液, 4℃上下輕輕搖勻, 30 min～1 h左右 15℃離心, 10 000 g, 約20 min。取上清超濾除鹽。

1.3.3 酚提取方法[11-13]

酚提取緩沖液: 0.7 mol/L 蔗糖 0.1 mol/L KCL; 0.5 mol/L Tris-HCl pH7.5; 50 mmol/L EDTA。儲存在4℃約1個月。β-巰基乙醇終濃度2%(體積分數), PMSF終體積分數為1 mmol/L(儲存液用異丙醇配成100 mmol/L), 使用前添加。也可以使用全效蛋白酶抑制劑。

(1) 取研磨好粉末加入酚提取緩沖液, 晃勻放置10 min, 4℃, 間或搖晃幾次。

(2) 加入等體積pH7.5 Tris 飽和酚。

(3) 4℃震蕩混合物30 min, 然后5 000～10 000g, 4℃離心30 min, 酚溶解的蛋白質, 色素, 脂類在酚相中; PVPP, 不溶的細胞碎片, 糖類, 核酸, 鹽都存在于水相或形成沉淀。

(4) 收集上層酚相, 丟棄水相和沉淀(不要擾動界面上物質, 寧可浪費一些蛋白也不多吸污染物)。

(5) 加入與酚相體積相同的提取緩沖液, 重復3、4步驟兩次。

(6) 在收集酚相里加入5倍體積預冷的0.1 mol/L乙酸銨的甲醇溶液來沉淀蛋白質。在-20℃過夜, 蛋白形成白色沉淀(對大多數蛋白來說30 min可以沉淀, 一般來說過夜沉淀操作方便, 沉淀完全)。

(7) 5 000～10 000 g, 4℃離心30 min, 用槍頭小心吸取上清并丟棄。

(8) 加入兩倍體積的冰預冷甲醇來清洗沉淀(基于最后收集的酚相的體積), 輕輕混勻, 5 000～10 000 g, 4℃離心30 min, 用槍頭小心吸取上清并丟棄。

(9) 重復步驟8兩次。目的是為了除掉乙酸銨和酚, 脂類以及色素。

(10) 使用丙酮代替甲醇重復步驟9兩次, 方便除掉甲醇并使沉淀更快更有效的干燥。

(11) 把沉淀晾干(如果有顏色, 說明存在色素或氧化的酚類化合物污染, 可以重新用酚提取, 但是要注意蛋白的損失)。

其二，已有研究表明，教師在理解和講授統計和概率方面存在許多困難，其主要難點在于數據分析觀念的滲透，這就需要教師不斷提高自己的專業素養.首先，教師自身需要有數據分析觀念的意識.其次，教師應具備引導學生形成數據分析觀念的能力.因此，如何對教師進行統計教育和培訓是一個巨大的挑戰.職前教師教育應加強理論和應用統計學的學習，培養統計思維和教學觀念等.在職教師培訓應以實際問題為導向，注重教師的實踐經驗，合作學習和交流，從而使教師能夠自我分析和反思.

(12) 把粉末轉移到1.5 mL離心管中, 加裂解液溶解, 離心取上清測蛋白濃度。

(13)可用超濾管濃縮至所需濃度, 凍存在-20℃或者－80℃。

1.4 蛋白濃度測定

參照Bradford方法[14]測定提取的條斑紫菜葉狀體總蛋白質濃度。

1.5 雙向電泳

等電聚焦: 采用 IPGphor等電聚焦系統, 17 cm 的 IPG膠條, pH=3～10。

(1)取凍存蛋白溶解和上樣緩沖液按1:4比例上樣, 離心15 000 r/min, 30 min, 17 cm膠條上樣1 mg蛋白和緩沖液混合后總體積300～600 μL。

(2)上樣, 取膠條至于聚焦盤里吸收液體 1 h。然后覆蓋礦物油, 50 V電壓下主動水化 16 h, 水化結束后用洗瓶沖洗膠條兩次, 把膠條背面放在濾紙上吸去多余水分和礦物油, 放到另一根槽里, 分別用濕潤濾紙做鹽橋, 覆蓋礦物油, 進行聚焦。等電聚焦參數如表1:

表1 等電聚焦電泳(IEF)參數 Tab. 1 The parameters of isoelectric focusing electrophoresis (IEF)

SDS-PAGE電泳: 使用 DALT—Six系統, 進行 SDS-PAGE電泳。溫度 l5℃, 80V×30min, 200 V電泳至溴酚蘭前沿剛好跑出凝膠。

1.6 凝膠染色及分析

染色采用改進的膠體考馬斯亮藍染色法[15], 圖像掃描采用BioRad GS-800, 軟件分析采用PDQuest 2-DE 8.0.1。

2 結果

2.1 3種方法提取條斑紫菜葉狀體總蛋白的圖譜結果

通過雙向電泳分析, 比較了3種方法的提取效果, 由圖1可以看出飽和硫酸銨沉淀法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所得圖譜結果比較相近, 背景比較重, 在酸性區聚焦不是很好, 低分子量區域出現橫向條紋及不規則的蛋白點, 蛋白集中度高, 使多個蛋白點連在一起或成線狀, 形成拖尾和糊狀使蛋白點的等電點難以確定, 影響蛋白質的分布和觀察, 尤其在堿性端出現大量空白幾乎無蛋白質點出現, 而且在高分子量區也只檢測到很少的幾個蛋白質點。酚提取方法所得到的圖譜背景干凈, 分離效果比較理想, 基本沒有縱向條紋, 橫向擴散也很輕微。蛋白質點較多, 尤其在堿性范圍內和高分子量區域的蛋白質點較另兩種法明顯增多而且蛋白質點比較清晰, 大多數蛋白質點呈圓形或橢圓形, 清晰可見。這說明飽和硫酸銨沉淀法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所得到的樣品中鹽離子和其他干擾雜質比較多, 而酚提取方法則能很好的除掉這些鹽離子和雜質, 保證聚焦的順利進行。

2.2 3種提取方法獲得的蛋白量差異比較

蛋白質獲得量及純度的高低是檢驗提取方法優劣的主要指標。圖2和圖3對3種提取方法分別從1 g材料所獲得的粗蛋白量、純蛋白量以及蛋白質純度等進行比較分析。數據顯示, 在蛋白獲得量方面, 飽和硫酸銨沉淀法獲得的粗蛋白量最高, 其次是三氯乙酸/丙酮沉淀法, 酚提取方法所得含量最低; 而3種方法所獲得的純蛋白量比較, 酚提取方法遠遠高于其他兩種方法。蛋白質純度是影響電泳結果的關鍵因素, 從蛋白純度這方面來看, 酚提取方法也要遠遠高于其他兩種方法, 這可能與提取方法的除雜效果有關。由這種結果可以看出, 飽和硫酸銨沉淀法去除樣品雜質不完全, 提取率較低; 三氯乙酸/丙酮沉淀法獲得的蛋白樣品純度可以, 但可能會對樣品蛋白造成的損失較大; 酚提取方法獲得的蛋白樣品純度較高, 雜質處理較好。

2.3 3種方法所得圖譜在蛋白點的數目比較

飽和硫酸銨沉淀法和三氯乙酸/丙酮沉淀法取的樣品中大部分蛋白質已丟失, 雜質太多, 蛋白質斑點比較少, 分別為163和178; 酚提取方法使蛋白質組分得到有效分離, 蛋白質樣品的雜質大大減少, 能檢測出587個點。由此可見飽和硫酸銨法雜質難除, 影響電泳; 三氯乙酸/丙酮沉淀法, 變性沉淀的蛋白質使沉淀后的蛋白溶解比較困難, 導致蛋白的大量損失; 酚提取方法除雜效果較其他兩種方法好, 所提蛋白質純度高, 所得到蛋白點較多, 能反映出蛋白點的分布。

圖l 條斑紫菜葉狀體總蛋白的提取 Fig. 1 Total proteins extracted from thalli of Porphyra yezoensis

圖2 不同提取方法蛋白量比較 Fig. 2 Comparison of the crude protein yields by different extration methods

圖3 不同提取方法蛋白量比較 Fig. 3 Comparison of the pure protein yields by different extration methods

圖4 3種方法所得蛋白點數比較 Fig. 4 Classification of protein spots with different extration methods

3 討論

樣品制備是雙向電泳的第一步, 其成功與否是決定雙向電泳成敗的關鍵。蛋白提取過程有幾條原則需要遵循: (1)盡可能溶解全部蛋白質, 打斷蛋白質之間的非共價鍵結合, 使樣品中的蛋白質以分離的多肽鏈形式存在; (2)避免蛋白質的修飾作用和蛋白質的降解作用; (3) 避免脂類、核酸、鹽等物質的干擾作用; (4)蛋白質樣品與第一向電泳的相容性[16]。近年來雙向電泳技術在植物應用中不少報道, 但大部分集中在一些高等模式生物上, 對于條斑紫菜的應用還沒見報道, 條斑紫菜富含色素, 多酚, 多糖等次生代謝產物和大量鹽分, 其蛋白樣品制備相對于其他植物更加困難。

本實驗分別采用了飽和硫酸銨沉淀法、三氯乙酸-丙酮沉淀法、酚提取法提取蛋白。結果顯示飽和硫酸銨沉淀法所得蛋白樣品中殘留雜質太多, 最終蛋白樣品在進行第一向電泳時無法很好聚焦, 影響了電泳, 使最終圖譜結果不理想。三氯乙酸-丙酮沉淀法則較好解決了以上的鹽離子濃度高的難題, 制備過程也相對簡單, 但蛋白質沉淀下來后較難重懸, 樣品得率較低。酚提取法采用先溶解提取蛋白質, 然后再沉淀離心的方法, 在提取上利用Tris一飽和酚的特性, 即酚是蛋白質的良好溶劑, 在樣品制備過程中, 蛋白質和脂類溶于酚相, 鹽、核酸、多酚和多糖等可溶性物質進入水相, 與酚相中的蛋白質分開[12], 另外, 在實驗過程中加入PVPP可以有效的去除多 酚[11], 使所得蛋白樣品受多糖、色素、脂類、核酸、鹽等物質的干擾最小, 得到的電泳圖譜最理想, 很多富含多糖植物組織蛋白質的提取一般采用酚提取法, 另外在3種方法所獲得粗蛋白質量和蛋白點數目的比較上, 直觀地看出相比于前兩種方法, 酚提取方法和發現酚提取法能更好地提取蛋白和除去樣品的鹽離子及其他干擾雜質, 獲得的蛋白樣品純度較高, 為提高其他大型海藻的總可溶性蛋白提取提供了重要參考。

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