皺紋盤鮑腸道菌群組成及PCR-DGGE指紋圖譜分析

冷曉飛, 姜海峰, 劉小林, 王高學, 張 艷, 高洪濤, 常亞青

(1. 大連太平洋海珍品有限公司, 遼寧 旅順 116045; 2. 西北農林科技大學 動物科技學院, 陜西 楊凌 712100; 3.大連海洋大學 農業部海洋水產增養殖學重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

動物腸道的正常菌群是腸道的正常組成部分, 水生動物的腸道微生物與宿主以及所處的水生環境形成的相互依賴、相互制約的微生態系, 對營養物質的消化吸收、 免疫反應以及器官的發育等方面具有其他因素不可替代的作用[1]。并且, 隨著對益生菌研究越來越多的關注, 很多研究表明水生動物腸道優勢菌和次優勢菌可以作為益生菌, 而且具有更好的定植效果[2-3]。皺紋盤鮑(Haliotis discus hannaiIno)是中國北方海域重要的養殖珍品。近幾年來, 隨著集約化程度的提高, 養殖皺紋盤鮑病害頻繁發生, 給苗種、成鮑生產造成很大的經濟損失。與此同時, 對皺紋盤鮑病害尚無有效的防治措施[4]。細菌性病害的原因很大程度上由環境和體內外的菌群結構失衡引起的[5], 研究其腸道菌群結構與組成, 對糾正機體菌群失調、增強機體體質和開發苗種培育、人工養殖中的益生菌制劑應用具有重要的意義。最早Sawabe等[6]研究了日本海域的皺紋盤鮑腸道內的微生物區系, 證明了不同環境下腸道菌群結構與組成具有顯著的差異。而對我國海域的皺紋盤鮑腸道內微生物區系研究尚未見報道。因此本研究著重于研究人工養殖的皺紋盤鮑和野生皺紋盤鮑腸道中微生物的組成和數量, 并采用PCR-DGGE指紋圖譜技術分析二者的相似度, 初步探討了人工養殖階段對皺紋盤鮑腸道菌群的影響, 從而對皺紋盤鮑腸道菌群有一個初步的了解。為進一步深入研究皺紋盤鮑疾病防控以及鮑魚專用益生菌制劑的研制提供科學基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

10只健康野生皺紋盤鮑平均體質量126.72g±10.71 g、平均殼長10.34cm±0.22cm于2010年10月由潛水員采集于遼寧省旅順口區海域, 稱謂野生組; 10只健康養殖皺紋盤鮑平均體質量122.70g±15.50g、平均體長10.33cm±1.15cm隨機挑選于遼寧省旅順口大連太平洋海珍品有限公司養殖場稱謂養殖組。養殖組鮑魚從剝離后開始投喂粉狀配合餌料, 5個月后改為籠養飼喂海帶。

1.2 方法

1.2.1 可培養細菌的分離、純化

參照Sawabe等[6]方法: 無菌條件下, 用手術刀將軟組織同殼分離后立即浸入70%酒精1min消毒體表, 再用無菌水沖洗數遍。用鑷子及剪刀取下皺紋盤鮑消化道, 置于預先稱重的無菌離心管中稱重并編號。為探討個體間差異, 對養殖組和野生組每個皺紋盤鮑個體的腸道樣品進行單獨分離。分離得到的樣品經研磨后梯度稀釋至10-4, 分別吸取各個稀釋度0.1 mL涂布2216E平板, 每個稀釋度涂3個平板, 22℃培養5 d。將剩余的研磨樣品分為養殖組和野生組均勻混合后保藏于-80 ℃冰箱中備用。培養結束后取適當稀釋度的平板計算細菌菌落數, 并依據菌落的形態特征及菌體形態特征進行分類并統計各類型細菌的比例。 隨機挑取各類型菌株在2216E平板上分離純化3次, 單克隆菌株保種于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 細菌鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取單克隆菌株的DNA作為模板, 分別擴增16S rDNA基因片段, 將獲得的16S rDNA基因序列于GenBank中比對以獲得序列信息, 并構建系統發育樹。將序列信息提交至GenBank中的核苷酸數據庫中。

1.2.3 腸道微生物總DNA提取

采用細菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取腸道微生物總DNA, 操作步驟按照產品說明書進行。提取的總DNA采用微量核酸定量儀(Nano drop 2000)測定DNA濃度, 置-20℃保存備用。

1.2.4 PCR-DGGE指紋圖譜分析

采用16S V3可變區通用引物(F357-GC和R518)對2個樣品中的腸道細菌進行PCR -DGGE指紋分 析[7], 10%聚丙烯變性膠分離V3區擴增片段, 變性劑梯度范圍為40% ～60%。每個加樣孔加入10×Loading buffer 10 μL和樣品PCR產物30 μL的混合樣品。先在40 V下電泳1 h, 然后80V電泳10～12 h。

凝膠染色, 電泳結束后, 凝膠于EB染液中染色20 min, 用Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像。采用Quantity One(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)軟件分析指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 皺紋盤鮑腸道細菌數量和組成

養殖組和野生組可培養的好氧及兼性厭氧菌數量分別為(3.50±0.85)×106個/g, (3.03±1.10)×106個/g。根據在2216E培養基上的不同菌落形態及菌體形態特征, 共分離到12類細菌。從中選出具有代表性的43株菌株測序(GenBank登錄號: JQ083308- JQ083350)結果表明: 這13類細菌分別與8個屬相似度較高, 分別為弧菌屬(Vibrio)、玫瑰桿菌屬(Roseobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)、火紅菌屬(Flammeovirga)、古名菌屬(Tamlana)、嗜瓊脂屬(Agarivorans)。其中, 火紅菌屬、古名菌屬、嗜瓊脂屬細菌具有降解瓊脂能力。弧菌主要種類有Vibrio halioticoli、Vibrio cyclitrophicus、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和Vibrio Alcanivorax; 希瓦氏菌由Shewanella colwelliana、Shewanella pacifica組成; 養殖組和野生組每個個體的腸道菌群組成及比例見表1。

從表1可以看出, 養殖組同野生組皺紋盤鮑腸道菌群組成相似度很高, 共有優勢菌均為Vibrio halioticoli。玫瑰桿菌屬、希瓦氏菌屬檢出率及比例較高, 可認為是皺紋盤鮑腸道的次優勢菌群。Vibrio halioticoli、玫瑰桿菌和希瓦氏菌在養殖組中的比例分別為76.47%±13.07%、9.74%±8.10%、6.54%±2.98%, 在野生組的比例分別為 81.89%±10.70%、7.74%±4.27%、10.28%±6.71%。其余種類細菌的檢出率及所占比例都很低。其中, 芽孢桿菌僅在養殖組中檢出, 且檢出率較高(80%), 屬于養殖組的特異性細菌。此外, 從表中可以看出個體間腸道細菌組成和比例差異很大。

2.2 16S rDNA V3可變區指紋圖譜的建立及分析

針對兩種皺紋盤鮑腸道細菌的16S rDNA基因得到的DGGE指紋分析圖譜及模式圖(圖1): 養殖組和野生組條帶分別有14條與12條, 表明皺紋盤鮑腸道具有豐富的微生物區系。其中, 野生組泳道中12個條帶對應位置均對應有養殖組的條帶, 而養殖組泳道中band2、band7屬于特異性條帶; 共有條帶中band4、band5和band14豐度較高, 表明皺紋盤鮑腸道中優勢的菌株種類約為3種。用戴斯系數Cs(Dice coefficient)計算兩樣品的相似性[8],Cs=2j/(a+b)(j是樣品A與B間相同的條帶。a和b分別是各自的條帶數), 可知養殖組腸道菌群同野生組的相似性系數為92.31%(24/26)。

3 討論

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圖1 養殖組皺紋盤鮑及野生組皺紋盤鮑腸道細菌16S rDNA的PCR-DGGE指紋圖譜及模式圖 Fig.1 PCR-DGGE fingerprint and its pattern of the V3 region of 16S rDNA of the bacteria from the gastrointestinal of Haliotis discus hannai

關于海洋軟體動物腸道菌群組成的研究相對于海水魚類很少, 幾乎大多數的研究表明海水魚類腸道的優勢菌同海水中優勢菌群結構一致, 均為弧菌 或假單胞菌[9]。Tanaka等[10]采用常規培養方法分析了日本海域的不同發育階段皺紋盤鮑腸道內細菌變化規律: 1齡后的個體微生物區系趨于穩定, 主要為具海藻酸降解酶活力的不動發酵菌(Alginolytic、 non-motile fermenters)、弧菌屬(Vibrio)、噬纖維菌屬(Cytophaga), 其中, NMF(non-motile fermenters)細菌占腸道菌群總數量的80%以上,V. halioticoli占 NMF的96%。從大連海域皺紋盤鮑腸道菌群結構發現, 野生與人工養殖主要由V. halioticoli(比例≥76%)、玫瑰桿菌(比例≥7.74%)和希瓦氏菌(比例≥6.54%)組成, 同日本海域皺紋盤鮑腸道菌群組成具有一定的差異。大連海域的皺紋菌群中V. halioticoli占主導, 希瓦氏菌和玫瑰桿菌檢出數量較多, 但并未檢出噬纖維菌; 希瓦氏菌和玫瑰桿菌均為海水中豐度較高的細菌, 在很多水生動物腸道內及藻類表面均有發現[11-13], 可能通過皺紋盤鮑攝食進入腸道內并定植。有研究表明水域環境對魚類腸道微生物菌群結構具有顯著的影響[14], 日本海域同大連海域皺紋盤鮑腸道菌群組成的差異的原因可能是由于水域環境的不同。

對比大連海域養殖組和野生組個體間腸道菌群組成, 總體上看, 野生組和養殖組腸道細菌組成差異很小。關于魚類的腸道菌群研究中有報道表明不同種類魚的腸道菌群具有特異性, 這可能與自身免疫有關[15-16], 而皺紋盤鮑在不同養殖環境下的腸道菌群組成的高度相似性同樣反映了貝類腸道對其共生細菌具有特異選擇性。值得注意的是, 芽孢桿菌僅在養殖組中檢出, 其來源于人工養殖環境或餌料有待于進一步研究。

Sawabe等[6]報道皺紋盤鮑腸道可培養的細菌數量為106～109個/g, 本研究中皺紋盤鮑可培養的好氧及兼性厭氧菌的平均數約為106個/g, 與之相比處于正常水平。另外, Ring? 等[17]指出魚類不同個體間由于受攝食、健康狀況等不定因素的影響, 腸道細菌數量存在較大差異, 與本文研究結果相符。

分析16S rDNA 指紋圖譜表明, 養殖組和野生組皺紋盤鮑腸道細菌組成的相似度很高(Cs=92.31%), 同常規培養方法得到的結果相吻合。養殖組和野生組有12個共有條帶, 養殖組有2條特異性條帶(band2、band7), 進一步說明了養殖皺紋盤鮑腸道菌群結構同野生皺紋盤鮑發生了改變, 但人工組兩條特異性條帶的豐度相對較低, 說明其所代表的細菌在腸道中的數量并不占優勢。外來細菌在皺紋盤鮑腸道菌群中不能占優勢的原因可能與皺紋盤鮑對腸道共生微生物的特異選擇性相關。

鮑魚是海洋植食性動物, 腸道細菌對降解海藻及營養合成具有重要的作用[18-19], 對分離得到的腸道細菌的特性進行研究可以更加深入了解皺紋盤鮑腸道細菌的共生關系。在下一步的工作中, 作者將通過對皺紋盤鮑腸道細菌產酶和拮抗能力進行研究, 并將指紋圖譜上的條帶回收測序, 確定皺紋盤鮑腸道微生物區系, 以便于深入了解皺紋盤鮑腸道微生態規律, 為鮑魚專用益生菌的開發奠定基礎。

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