復宮寧對大鼠異位子宮內膜細胞形態及caspase-3 和Bcl-2 蛋白表達的影響*

黃越燕， 肖 純， 尹滿香， 劉春花， 喬玉丹， 施 旻， 王曉敏， 徐優慧

(1嘉興學院醫學院，浙江 嘉興314001;2江西中醫學院基礎醫學院，江西 南昌330004;3武警浙江省總隊醫院病理科，浙江 嘉興314000)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMT)是婦科常見病，近年來其發病率逐年增加［1］。EMT 的發病原因及發病機制尚未清楚，故給治療帶來了一定的困難。現代醫學治療本病多以藥物和手術為主，因其副作用明顯，復發率較高，常難以為患者接受。中醫藥治療子宮內膜異位癥積累了豐富的臨床經驗［2-4］。復宮寧是江西省中醫院臨床治療內異癥的經驗方，具有活血化瘀、通絡和消瘕散結之功，本實驗主要采用HE 染色、透射電鏡技術及免疫組化方法觀察復宮寧實驗組異位內膜細胞形態結構和凋亡蛋白表達的變化，并與模型組和達那唑治療組相比較，從凋亡的角度，以探討復宮寧制劑的作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 藥品制備、試劑

復宮寧制劑由三棱、莪術、紅花、蒲黃、延胡、白芍、菟絲子、巴戟天等中藥經水提法制成每mL 含生藥2 g，大鼠每天劑量1.0 g/kg 和2.0 g/kg。達那唑(danazol)膠囊:上海醫藥有限公司華聯制藥廠，產品批號為090801，用蒸餾水配成每mL 含膠囊25 mg。Caspase-3 和Bcl-2 抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 動物模型制作

健康雌性SD 大鼠，50 只，體重(200 ±50)g，由南昌大學實驗動物中心提供，在江西中醫學院病理實驗室完成實驗。實驗動物適應性飼養15 d，每天同一時間陰道涂片，觀察大鼠動情周期。在第3 個動情周期的動情期，采用自體子宮內膜移植法［5］建立EMT 大鼠模型。以1%戊巴比妥鈉麻醉，開腹找到子宮，切下左側子宮角中段長約1 cm，行端對端吻合術。將剝離的子宮內膜組織剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的內膜塊，縫合在左側子宮系膜，縫合切口。術后動物分籠單放，讓其自然蘇醒。常規飼養。

3 分組及給藥

造模4 周后取經剖腹證實造模成功的大鼠40只，隨機分為4 組，即:復宮寧治療1 組、復宮寧治療2 組，達那唑治療組和模型組，每組10 只。其中復宮寧1 組和2 組分別按1.0 g·kg－1·d－1和2.0 g·kg－1·d－1給藥，達那唑組以100 mg·kg－1·d－1給藥，模型組給予等容量生理鹽水。每天1 次灌胃。持續給藥4 周。

4 儀器

SZK 型醫用超凈工作臺，PH140A 型培養箱/干燥箱，LXJ-64-01 型離心機，SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器，BX-41 型光學顯微鏡及攝像系統，Q550CW 圖像信息采集與分析系統等。

5 標本的采集與處理

于末次用藥24 h 后，剖腹，取下異位病灶，分離周圍黏連組織。取右側子宮中段(在位內膜)1 cm和異位內膜作為標本，置于10% 中性甲醛溶液和2.5%戊二醛中固定備用。移植物(異位病灶)成活標準:肉眼可見移植物增大，呈隆起的小泡狀，有些形成多房的囊腫，充滿黃色或清亮漿液，被結締組織覆蓋并有血管形成，部分移植物呈黃色或褐色小結。雙腳規測量移植物體積(長×寬×高)，單位mm3。以2.5%戊二醛固定的組織用于制作超微切片，透射電鏡觀察子宮內膜細胞的凋亡情況。

6 異位和在位內膜HE 染色及觀察

標本固定48 h 后取出，經常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚3 ～4 μm)、脫蠟、水化，HE 染色觀察。

7 免疫組化法分析活化caspase-3 及Bcl-2 蛋白的表達

將在位、異位內膜石蠟切片標本，進行免疫組化染色，采用SP 法染色，DAB 顯色。結果判定:采用H-score 法［6］，由兩位病理醫師雙盲觀察染色均勻的切片，每張切片隨機選擇5 個不同高倍視野(×400)觀察選擇在位、異位內膜組織的被覆上皮所有細胞，記錄陽性染色(即胞質或/和胞膜呈棕黃色)的細胞百分數并計分。 ＜5%的陽性細胞，計0 分;5% ～10%的細胞呈陽性，計1 分;11% ～50%的細胞呈陽性，計2 分;＞50%的細胞呈陽性，計3 分。細胞著色強度以多數陽性細胞呈現的染色(棕黃色)為強著色，計3 分;淡黃色為弱陽性，計1 分;兩者之間的黃色為中等著色，計2 分。將陽性細胞百分數計分和染色強度計分相加，為免疫組化積分(兩位醫師觀察結果如有不同，取二者計分之和的平均數)。

8 統計學處理

用SPSS 13.0 統計軟件進行處理。數據以均數±標準差(mean ±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗，采用Spearman 等級相關分析檢驗caspase-3 及Bcl-2 蛋白表達的相關性，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 復宮寧對異位囊腫體積的影響

用藥前各組病灶體積無差異;用藥后，復宮寧與達那唑對大鼠異位內膜均具有明顯的抑制作用。復宮寧組病灶明顯縮小，與模型組和用藥前相比均有顯著差異(P ＜0.01);與達那唑組相比無顯著差異(P ＞0. 05)。達那唑組與模型組比病灶體積縮小(P ＜0.01)，與用藥前比病灶體積縮小(P ＜0.01)。模型組自身前后比較，體積不但無縮小，反而繼續生長(P ＜0.05)，說明病變在發展中，見表1。

表1 復宮寧對異位囊腫體積的影響Table 1. Effect of Fugongning on volume of ectopic cysts in rats with endometriosis(mm3.Mean±SD.n=10)

2 組織形態學變化

光鏡下模型組異位內膜形成封閉的環形結構，較在位內膜薄，內膜上皮為單層柱狀、立方狀，大部分上皮細胞有分泌現象(可見核下空泡)，可見薄層間質和豐富的血管，有的見少量腺體或少量含鐵血黃素及中性粒細胞浸潤，見圖1。達那唑組異位、在位內膜腺上皮層明顯變薄，細胞呈柱狀或低柱狀甚至扁平狀松散排列，細胞核不規則，位置不定，見圖2。復宮寧組異位內膜上皮呈低柱狀、扁平狀，單層松散排列，部分病灶內膜萎縮呈線狀或者內膜脫落、消失。間質細胞明顯減少，甚至缺如，周圍血管少。僅個別病灶內見少量腺體。而在位的子宮內膜則無明顯變化，上皮細胞、腺體及間質細胞均無萎縮現象，見圖3。

Figure 1. Endometrial tissues in model group (HE staining，×200). A:endometriotic lesion，with high columnar epithelium and vascular hyperemia;B:cystic endometriotic lesion，with columnar glandular epithelium and inflammatory cells in the cavity;C:eutopic endometrium，with a few inflammatory cells infiltrating in glandular epithelium，and nondecreasing glands.圖1 模型組子宮內膜組織

Figure 2. Endometrial tissues in danazol treatment group (HE staining，× 200). A:high-columnar glandular epithelial hyperplasia in endometriotic lesion around ovarian;B:glandular epithelial hyperplasia and inflammation being inhibited in endometriotic lesion;C:various degrees of atrophy in eutopic endometrial epithelium and glands.圖2 達那唑治療組子宮內膜組織

Figure 3. Endometrial tissues in Fugongning treatment group(HE staining，×100). A:significantly-reduced endometriotic lesion，with little intracavitary secretion，and cyst wall fibrosis;B:atrophy and lowering in part of endometriotic epithelium，and cyst wall hemosiderosis;C:abundant glands in eutopic endometrium，with secretion but no atrophy.圖3 復宮寧治療組子宮內膜組織

3 超微結構改變

透射電鏡顯示:模型組異位內膜上皮結構完好，細胞界限清晰，有細纖毛和溶酶體，線粒體、高爾基體等細胞器。達那唑組異位內膜上皮可見纖毛減少或消失，線粒體等細胞器結構不清，部分上皮細胞凋亡。復宮寧組異位內膜上皮胞體收縮，失去微絨毛，胞漿濃縮，核染色質密度增高并凝聚于核膜周邊，核仁裂解;細胞膜內陷和凋亡小體形成，見圖4。

Figure 4. Ultrastructual changes of endometrial epithilial cells. A:model group (×4 000);B:danazol treatment group (×4 000);C:Fugongning treatment 1 group (×4 000);D:Fugongning treatment 2 group (×8 000).圖4 子宮內膜上皮細胞的超微病理學改變

4 活化caspase-3 蛋白表達特征

活化caspase-3 蛋白在各組在位、異位內膜的腺上皮細胞和間質細胞的胞質中表達，呈不同程度黃色或棕黃色的顆粒，見圖5。陰性對照片中所有細胞均無著色。各組在位內膜活化caspase-3 蛋白表達水平較一致(P ＞0.05);各組異位內膜活化caspase-3蛋白表達水平不同，復宮寧1 組、2 組活化caspase-3蛋白表達明顯高于模型組(P ＜0.01)。復宮寧1 組、2 組在位內膜活化caspase-3 蛋白表達水平明顯低于異位內膜(P ＜0.01)，模型組和達那唑組在位內膜與異位內膜活化caspase-3 蛋白表達無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

Figure 5. Activated caspase-3 protein expression in endometrial tissues (immunohistochemical staining). A:low expression in ectopic endometrium from model group(×400);B:high expression in ectopic endometrium from Fugongning treatment group(×400);C:low expression in eutopic endometrium from Fugongning treatment group(×200).圖5 子宮內膜組織活化caspase-3 蛋白的表達

表2 各組在位、異位內膜活化caspase-3 蛋白表達水平的比較Table 2. Expression of activated caspase-3 protein in eutopic and ectopic endometrial tissues from different groups (mean±SD. n=10)

5 Bcl-2 蛋白表達特征

Bcl-2 蛋白主要表達于各組在位、異位內膜的腺上皮細胞，主要在胞質和胞膜表達，表現為不同程度黃色的顆粒，淋巴細胞和子宮平滑肌細胞可呈陽性表達，子宮內膜間質未見表達，見圖6。各組在位內膜Bcl-2 蛋白表達水平較一致(P ＞0.05);各組異位內膜Bcl-2 蛋白表達水平不同，復宮寧1 組、2 組Bcl-2 蛋白表達明顯低于模型組(P ＜0.01)。復宮寧1組、2 組異位內膜Bcl-2 蛋白表達水平明顯低于在位內膜(P ＜0.01)。模型組恰恰相反，異位內膜Bcl-2蛋白表達水平明顯高于在位內膜(P ＜0.05)。達那唑組異位內膜與在位內膜Bcl-2 蛋白表達水平無顯著差異(P ＞0.05)，見表3。

Figure 6. Bcl-2 protein expression in endometrial tissues (immunohistochemical staining，×200). A:high expression in ectopic endometrium from model group;B:low expression in ectopic endometrium from Fugongning treatment group;C:high expression in eutopic endometrium from Fugongning treatment group.圖6 子宮內膜組織Bcl-2 蛋白的表達

表3 各組在位、異位內膜Bcl-2 蛋白表達水平的比較Table 3. Expression of Bcl-2 protein in eutopic and ectopic endometrial tissues from different groups (mean ±SD. n =10)

6 各組異位內膜Bcl-2 與caspase-3 表達的相關性

經Spearman 等級相關分析，各組異位內膜bcl-2蛋白的表達水平與caspase-3 蛋白的表達水平呈負相關(r=－0.377，P ＜0.05);而各組在位內膜兩者的表達未顯示其相關性。

討 論

EMT 是具有生長功能的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆黏膜以外身體的其它部位引起的疾患，其臨床表現為痛經、月經失調、不孕、盆腔包塊等。病情反復，臨床難以根治。EMT 發病機制尚不完全清楚，目前多數學者認為，它可能是一種在免疫及細胞凋亡異常基礎上發生經血逆流而導致的綜合結果［7］，而凋亡是子宮內膜細胞保持周期性結構和功能穩定的關鍵因素，異位內膜細胞得以在宮腔外種植并繼續存活，與其對凋亡的抵抗力增強有關［8］。子宮內膜入盆、腹腔后，在異位逃避機體免疫系統的監視而存活、種植，為EMT 的發病創造了有利條件。

中醫對內異癥從病因病機、治法治則上形成了較完善體系并在一定程度上達成共識:認為多因外感寒熱濕邪，或內傷七情及婦科宮腔手術創傷等所致，“瘀血阻滯胞宮、沖任”是其基本病機，治療上大多以活血化瘀為大法。針對內異癥的病因病機，結合本院的臨床經驗，確立以活血化瘀、消瘕散結為治療原則的復宮寧制劑，同時兼顧導致淤血內阻的其它相關因素，理氣行血、散寒溫經、補腎益精。三棱、莪術消癥散結，能減少盆腔黏連，化散囊腫、包塊等子宮內膜異位病灶;紅花、蒲黃等活血通經、散瘀止痛;佐以巴戟天、淫羊藿、菟絲子補腎益精、溫里散寒，使血得溫則行，瘀血得消;加入延胡、白芍行氣止痛，使氣行則血行。全方藥簡功專，組方合理，具有免疫調節和誘導凋亡的功能，有效縮小或消除異位病灶，緩解痛經，改善月經不調，還可能提高內異癥伴不孕患者的受孕率。

本實驗采用經典的手術移植自體子宮內膜，建立EMT 模型，實驗結果表明模型組異位內膜增生，產生局部黏連，提示造模成功;復宮寧2 個劑量組均有不同程度的抑制異位內膜的增生，使其萎縮、退變、凋亡。本實驗觀察各組在位子宮內膜均未見凋亡現象，模型組異位內膜偶見凋亡細胞，這和文獻［9-12］報道一致。用復宮寧后，異位上皮細胞凋亡數明顯增多，與徐邦生等［13］研究消癥湯對子宮內膜異位癥模型大鼠異位內膜細胞增殖和凋亡的結果一致。復宮寧組異位內膜細胞凋亡現象明顯:電鏡下可見核染色質邊聚成新月狀，有的凝集成塊狀，或形成凋亡小體。有的細胞胞漿中有較多的溶酶體和腫脹空泡變的線粒體。提示復宮寧的療效機制，一方面是其促進了異位內膜上皮細胞的凋亡;另一方面，增多的溶酶體也可促進細胞的自溶;復宮寧致線粒體的空泡變性也十分明顯，必然引起細胞的能量代謝障礙，進一步使異位內膜細胞的萎縮和變性，最終促進異位病灶縮小和消失。本研究還通過免疫組化觀察，發現在復宮寧組，EMT 大鼠異位內膜腺上皮細胞Bcl-2 蛋白表達水平明顯低于其在位內膜，但模型組中卻相反。復宮寧組大鼠異位內膜腺上皮細胞caspase-3 蛋白的表達水平則明顯高于其在位內膜，達那唑組中兩者相差不明顯。我們將各組異位內膜Bcl-2 與caspase-3 表達的相關性經Spearman 等級相關分析，各組異位內膜Bcl-2 蛋白的表達水平與其caspase-3 蛋白的表達水平呈負相關(r =－0.377，P＜0.05);而在各組在位內膜兩者的表達未顯示其相關性。由此可見，復宮寧通過激活細胞中的caspase酶原活性及降低Bcl-2 蛋白在EMT 中的高表達，誘導異位內膜細胞的凋亡，而起到對異位內膜的抑制作用。Harada 等［14］進行了EMT 在位及異位內膜與正常女性子宮內膜對凋亡敏感性的比較實驗發現，EMT 患者在位及異位內膜對凋亡的敏感性均明顯下降，異位者較在位者下降更明顯，且無周期性變化，推測內膜組織自發凋亡減弱和對凋亡的敏感性降低是EMT 發生的原因之一。本實驗中，復宮寧治療組異位內膜有明顯凋亡現象，而在位內膜無明顯凋亡，是否通過影響內膜細胞對凋亡信號的敏感性不同來誘導細胞的凋亡，還有待于進一步研究探討。前期實驗中，我們發現，復宮寧制劑能夠通過降低異位內膜ER 和PR 的表達而起到抑制異位內膜生長的作用［15］。我們觀察到，達那唑能有效降低EMT 大鼠血清E2和P 水平，復宮寧制劑也有輕度降低EMT 大鼠血清E2和P 的作用，模型組血清E2和P 含量明顯高于正常組，說明復宮寧可以通過抑制大鼠E2和P 的異常分泌達到治療EMT 的目的。復宮寧制劑兼顧活血補腎祛瘀，對病人從整體進行調節，而且毒副作用小，可以長期服用，減少復發率。復宮寧能誘導異位子宮內膜細胞凋亡，與達那唑療效相似，其調控機制很可能與E2水平下降密切相關。但復宮寧降低E2 的作用不及達那唑，可能因此而具有保護正常子宮內膜的作用。

［1］ 郎景和.子宮內膜異位癥的基礎與臨床研究(第一卷)［M］. 第1 版.北京:中國協和醫科大學出版社，2003:228-242.

［2］ 涂飛霞，阮 菲，吳瑞瑾，等.STAT3 和SOCS3 與子宮內膜異位癥的相關性研究［J］.中國病理生理雜志，2012，28(1):152-154，158.

［3］ 劉蓉蓉，曹保利，李繼坤. 補腎祛瘀法對子宮內膜異位癥細胞凋亡的影響［J］.山西中醫，2008，24(10):54-56.

［4］ 鄒 杰，關 錚，張唯一，等. 散結鎮痛膠囊和達那唑對大鼠子宮內膜異位癥治療效果的比較［J］. 中國中西醫結合雜志，2012，32(8):1112-1116.

［5］ 肖 純，黃桂林，彭澤華，等.大鼠實驗性子宮內膜異位癥模型復制［J］. 中國病理生理雜志，1995，11(3):333-334.

［6］ Ota H，Igarashi S，Sasaki M，et al. Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis adenomyosis ［J］. Hum Reprod，2001，16(3):561-566.

［7］ Hastings JM，Fazleabas AT. Future directions in endometriosis research［J］. Semin Reprod Med，2003，21(2):255-262.

［8］ Garcia-Velasco JA，Arici A. Apoptosis and the pathogenesis of endometriosis［J］. Semin Reprod Med，2003，21(2):165-172.

［9］ 王 曼，俞 瑾，錢祖淇.子宮內膜異位癥、妊娠高血壓綜合征及女性不孕癥的中西醫結合診療標準［J］. 中西醫結合雜志，1991，11(6):376-379.

［10］Dmowski WP，Ding J，Shen J，et al. Apoptosis in endometrial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis［J］. Hum Reprod，2001，16(9):1802-1808.

［11］ Braun DP，Ding J，Shen J，et al. Relationship between apoptosis and the number of macrophages in eutopic endometrium from women with and without endometriosis［J］.Fertil Steril，2002，78(4):830-835.

［12］高 穎，羅麗蘭，何福仙.異位子宮內膜細胞的凋亡與增殖的研究［J］. 中華婦產科雜志，1999，34(9):536-539.

［13］徐邦生，朱建華，蔡云平，等. 消癥湯對子宮內膜異位模型大鼠異位組織細胞增殖和凋亡的影響［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2003，12(3):281-285.

［14］Harada T，Kaponis A，Iwabe T，et al.Apoptosis in human endometrium and endometriosis［J］. Hum Reprod Update，2004，10(1):29-38.

［15］喬玉丹，張曉春，周志愉，等. 復宮寧對子宮內膜異位癥大鼠異位內膜雌、孕激素受體表達和動情周期的影響［J］. 時珍國醫國藥，2010，21(11):2743-2744.