吉西他濱對CD34 + CD38 － 髓系白血病干細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用*

韓慧娟， 胡亮杉， 鄧 蘭， 高瑩瑩， 郭坤元△

(1南方醫科大學珠江醫院血液內科，廣東 廣州510282;2廣東省第二人民醫院檢驗科，廣東 廣州510317)

吉西他濱(gemacitabine，GEM)是一種與Ara-C結構相似的新型的脫氧胞苷相似物和核苷還原酶抑制劑，它屬于抗代謝類抗癌藥物，主要作用于DNA合成期和G1后期，可阻止細胞由G1進入S 期［1］。有較強的細胞毒性，廣泛用于實體瘤的治療，不良反應小療效顯著［2-3］。國外陸續開展了吉西他濱聯合其它化療藥物治療難治性多發性骨髓瘤、淋巴瘤及自體造血干細胞移植治療的臨床試驗，結果顯示患者的緩解率和總的生存期較其它化療方案有所提高，而且其毒副反應發生相對輕微，具有良好的耐受性［4］。但有關急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的臨床試驗尚未見相關報道，目前對白血病的研究僅限于群體細胞研究。而白血病干細胞(leukemic stem cells，LSCs)是急性髓性白血病復發和耐藥的重要原因［5］，白血病研究治療應針對LSCs。因此本研究以處于LSCs 發育階段的CD34+CD38-KG1a 細胞為靶，以Ara-C 為對照，研究GEM 對其增殖、細胞周期及凋亡影響，為GEM 的白血病臨床應用提供一定的理論和實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人急性髓細胞白血病細胞株KG1a 細胞由中國醫學科學院血液學研究所饋贈，由本實驗室傳代，佘妙容等［5］成功將KG1a 細胞植入NOD/SCID 小鼠，獲得CD34+CD38-KG1a 細胞。GEM(純度＞98%;Sigma);阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C;哈爾濱博萊制藥有限公司)，0.4%臺盼藍染液(Gibco);RPMI-1640 液體培養基(HyClone);胎牛血清(杭州四季青公司);Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司);細胞周期檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);CD34-PE、CD38-FITC 及同型對照小鼠抗人抗體(Biolegend);低熔點瓊脂(Amresco)。

2 方法

2.1 KG1a 細胞培養 KG1a 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，2 ～3 d 傳代。

2.2 流式細胞術檢測KG1a 細胞表面CD34 和CD38 抗原表達 收集5 ×105個對數生長期的KG1a細胞，2 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌2 次，100 μL PBS 重懸細胞后分別加入小鼠抗人單克隆抗體CD34-PE 和CD38-FITC 各20 μL，室溫下避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，即刻上機檢測。以同型對照FITC 和PE 熒光抗體為對照，流式細胞儀檢測，實驗重復3 次。

2.3 流式細胞術檢測KG1a 細胞周期及凋亡變化

收集對數生長期KG1a 細胞1 ×106個接種于6 孔板，每孔2 mL，分別加入終濃度GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L)、Ara-C(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L )和生理鹽水(對照組)，24 h 后離心收集全部細胞，用1 mL PBS 重懸，取0.5 mL，PBS 洗2遍，用70%冰乙醇重懸細胞，-20 ℃固定過夜，PBS洗滌1 遍，棄上清加入300 μL DNA 染液(內含PI 100 mg/L 和RNA 酶2 ×104U/L)37 ℃避光染色30 min，PBS 洗滌2 遍，流式細胞儀檢測細胞周期。0.5 mL 用PBS 洗滌2 次，棄上清，用500 μL 的結合緩沖液重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復3 次。

2.4 軟瓊脂克隆法觀察KG1a 細胞增殖能力 將1.0%瓊脂糖與2 ×RPMI-1640 培養液(20%胎牛血清)等體積混合，制成0.5%底層瓊脂凝膠加入6 孔板，每孔1 mL，室溫凝固。(1)GEM 和Ara-C 作用24 h組:取對數生長期細胞，GEM、Ara-C(0.05 mg /L、0.1 mg/L、0.5 mg /L)及生理鹽水(對照組)作用24 h，2 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌2 遍，棄上清，重懸計數，調整細胞為每孔2 500個，加入到0.8%的瓊脂糖與2 × RPMI-1640 培養液等體積混合制成0.4%上層瓊脂凝膠中。(2)GEM 和Ara-C 持續作用組:取對數生長期細胞，調整細胞為每孔2 500 個，加入到0.8%瓊脂糖與2 × RPMI-1640 培養液等體積混合制成0.4%上層瓊脂凝膠中，每孔分別加入0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.5 mg/L GEM 和Ara-C，生理鹽水作為對照組，以上每組設3 個復孔，待凝固后將培養板置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度環境下培養，分別在14 d 和21 d 將培養板放置于倒置顯微鏡下觀察其形態，并拍照，以＞50 個細胞團為1 個集落，計數其集落數。

3 統計學處理

數據以均數± 標準差(mean ± SD)表示，應用SPSS 13.0 軟件處理，多組間均數比較采用析因設計資料的方差分析，兩組均數比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 KG1a 細胞表面CD34 和CD38 抗原的表達

流式細胞術檢測結果顯示，CD34+CD38-KG1a細胞占(98.02 ±0.72)%，即實驗用KG1a 細胞處于白血病干細胞發育階段，見圖1。

2 GEM 阻滯KG1a 細胞在G1/G0期

0.05 mg/L 和0.1 mg/L GEM 和Ara-C 培養24 h對KG1a 細胞的細胞周期均無影響(P ＞0.05)。而0.5 mg/L GEM 使KG1a 細胞進入G1/G0期，G1/G0期細胞增多(P ＜0.05)，S 期和G2/M 期細胞減少(P ＜0.05)。0.5 mg/L Ara-C 對G1/G0期和S 期細胞無明顯影響(P ＞0.05)，使G2/M 期細胞減少(P ＜0.05)。可見不同濃度GEM 作用KG1a 細胞24 h 后，G1/G0期細胞所占比例隨著藥物濃度的增大而增加，S 期與G2/M 期細胞比例相應下降，呈現G1/G0期阻滯現象，見圖2。

Figure 1. Percentage of CD34 + CD38 - acute myeloid leukemia KG1a cells.圖1 KG1a 細胞表面CD34 和CD38 抗原的表達

Figure 2. Effects of different concentrations of GEM and Ara-C on cell cycle of KG1a cells(for 24 h).A:0.05 mg/L GEM;B:0.1 mg/L GEM;C:0.5 mg/L GEM;D:0.05 mg/L Ara-C;E:0.1 mg/L Ara-C;F:0.5 mg/L Ara-C;G:control.圖2 不同濃度GEM 及Ara-C 對KG1a 細胞細胞周期的影響

3 吉西他濱抑制KG1a 細胞的集落形成能力

0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.5 mg/L GEM 作用KG1a 細胞24 h 后，每孔2 500 個，軟瓊脂培養第14 d，0.1 mg/L 和0.5 mg/L 組克隆數分別為376.00 ±28.75 和93.00 ±9.61，低于鹽水對照組(538.00 ±43.86，P ＜0.05)，第21 d 克隆數為390.00 ±27.06和97.00 ±8.02，低于鹽水對照組(599.00 ±16.01，P＜0.05)，0.05 mg/L GEM 組14 d 和21 d 克隆數分別為507.00 ±27.87 和686.00 ±61.10，與對照組(538.00 ±43.86 和599.00 ±16.01)相比，差異無統計學意義(P ＞0.05)。同時點同濃度GEM 與Ara-C組間相比，GEM 組集落均少于Ara-C 組，差異有統計學意義(P ＜0.05)，而Ara-C 低濃度組對KG1a 細胞無抑制作用，高濃度組有抑制作用，差異均有統計學意義(P ＜0.05)。0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.5 mg/L GEM 和Ara-C 持續作用組，每孔2 500 個，軟瓊脂培養14 d 和21 d 均未見集落生長，抑制作用強于對照組(538.00 ±43.86 和599.00 ±16.01，P ＜0.05)。這說明單次用藥Ara-C 對腫瘤干細胞抑制作用不明顯，而加大濃度及作用時間會增加對腫瘤干細胞的殺傷作用。而GEM 無論單次用藥還是持續用藥，對抑制KG1a 細胞及增殖作用均優于同濃度Ara-C 組，見圖3。

Figure 3. Effect of GEM on the colony formation and morphosis of KG1a cells (methyl violet staining，×100 in a，b，c，d and e). A:0.1 mg/L GEM for 24 h;B:0.1 mg/L Ara-C for 24 h;C:0.1 mg/L GEM for 21 d;D:0.1 mg/L Ara-C for 21 d;E:control.圖3 GEM 對KG1a 細胞集落與形態的影響

4 GEM 對KG1a 細胞的誘導凋亡作用

0.05 mg/L 和0.1 mg/L GEM 和Ara-C 對KG1a細胞的早、晚期凋亡率與鹽水對照組比較均無顯著差異(P ＞0.05)，而0.5 mg/L GEM 對KG1a 細胞的早、晚期凋亡率與鹽水對照組相比明顯升高(P ＜0.05)。而0.5 mg/L Ara-C 組與鹽水對照組相比晚期凋亡率無顯著差異(P ＞0.05)，早期凋亡率升高(P ＜0.05)，見圖4。這些結果表明，Ara-C 具有誘導細胞早期凋亡作用，無誘導晚期凋亡作用;濃度為IC50的GEM 對KG1a 細胞不具有早晚期誘導凋亡作用，增大藥物濃度對KG1a 細胞均具有誘導早、晚期凋亡作用，且其誘導凋亡作用優于同濃度Ara-C 組。

討 論

AML 是一種血液系統的惡性克隆性疾病，化療是治療AML 最常用且有效的手段之一［6］，盡管化療改善了患者病情緩解和遠期生存，但仍有15% ～25%患者因耐藥或者復發導致治療失敗和死亡，并且大于40%的緩解患者在2 年內復發。目前認為具有長期自我更新能力的LSCs 是白血病治療后耐藥和復發的主要根源。腫瘤干細胞是腫瘤起源、發展和轉移的種子細胞，只有消除腫瘤干細胞才能提高腫瘤的治愈率，LSCs 是白血病的腫瘤干細胞，以LSCs 為靶的治療正在成為各種治療的新定位［7］。LSCs 對AML 的治療策略應考慮聯合對LSCs 有抑制作用的化療方案，佘妙容等［5］成功將KG1a 細胞植入NOD/SCID 小鼠，獲得CD34+CD38-KG1a 細胞，研究表明CD34+CD38-的KG1a 細胞對蒽環類藥物耐藥并抵抗NK 細胞的殺傷效應，故本實驗采用CD34+CD38-KG1a 細胞為研究對象。

Figure 4. Effect of GEM on the apoptosis of KG1a cells (for 24 h).Mean±SD.n=3.圖4 GEM 對KG1a 細胞凋亡率的影響

核苷類藥物是急性白血病治療常用藥物，代表藥物為Ara-C。GEM 作為新型核苷類藥物，通過抑制核糖核苷酸還原酶和競爭性插入DNA 鏈中脫氧胞苷的位點導致DNA 鏈斷裂，阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡［8］。GEM 較Ara-C 相比，其水溶性和磷酸化效率比阿糖胞苷強，代謝活化產物對核苷激酶有更高的親和力，可增加其穿透靶細胞膜、抑制脫氧胞嘧啶脫氨酶、減少細胞內代謝物的降解，從而減緩藥物排泄，使細胞內可持續高水平積聚活化的核苷。GEM 具有自我增效、抗腫瘤活性強、抗瘤譜廣，且與其它化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加，給藥后迅速分布至全身等優點，但對白血病干細胞治療尚無相關研究。本實驗研究GEM 對具有抑制LSCs特性的CD34+CD38-KG1a 細胞的增殖及誘導凋亡作用。

研究表明，細胞周期失調是腫瘤細胞無限增殖的重要原因之一，本研究發現GEM 能使KG1a 細胞大多阻滯在G1/G0期，導致細胞分裂期細胞數量減少，細胞增殖受抑，并隨著濃度的增加抑制越明顯。軟瓊脂克隆實驗是體外檢測細胞自我更新和增殖潛能的有效方法，14 d 之前培養集落多為分化階段較晚、增殖能力較差細胞形成，21 d 培養的晚期集落主要由干/祖細胞形成，反映了干細胞的增殖潛能。在本研究中發現，在24 h 作用組，不同濃度GEM 均對CD34+CD38-KG1a 細胞的早期及晚期集落的形成顯著抑制，GEM 持續作用組在7 d、14 d 和21 d 均未見克隆生長，GEM 可較大限度抑制CD34+CD38-的KG1a 細胞的增殖。而Ara-C 組在0.05 mg/L 和0.1 mg/L 均不具有早、晚期集落抑制作用，0.5 mg/L 濃度Ara-C 對早期集落有抑制作用，但與同濃度GEM相比，抑制作用較弱，其抑制作用對晚期集落形成無明顯抑制作用。Ara-C 直接作用組在7 d、14 d 和21 d 均未見集落形成，說明單次用藥Ara-C 對腫瘤干細胞抑制作用不明顯，而加大濃度及作用時間會增加對腫瘤干細胞的殺傷作用，而GEM 無論單次用藥還是持續用藥，對抑制KG1a 細胞增殖作用均優于同濃度Ara-C 組。

本研究發現，0. 1 mg/L GEM 作用24 h 后對KG1a 細胞無誘導凋亡效應。而GEM 在大于0. 5 mg/L 濃度下具有早、晚期凋亡作用，誘導凋亡作用優于同濃度Ara-C 組。本實驗表明GEM 增殖抑制作用強于阿糖胞苷，可能是因為其有更好的胞漿穿透性，并通過將CD34+CD38-的KG1a 細胞阻滯在G1/G0期來發揮作用。

［1］ 黎建軍，古模發，劉立志，等.CIK 細胞回輸聯合吉西他濱和順鉑治療鼻咽癌放療后肝肺轉移瘤的效果及機制研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(2):272-277.

［2］ Davies AM，Ruel C，Lara PN，et al. The proteasome inhibitor bortezomib in combination with gemcitabine and carboplatin in advanced non-small cell lung cancer:a California Cancer Consortium Phase Ⅰstudy［J］. J Thorac Oncol，2008，3(1):68-74.

［3］ Peters GJ，van der Wilt CL，van Moorsel CJ，et al.Basis for effective combination cancer chemotherapy with antimetabolites［J］.Pharmacol Ther，2000，87(2-3):227-253.

［4］ Nieto Y，Thall P，Valdez B，et al. High-dose infusional gemcitabine combined with busulfan and melphalan with autologous stem-cell transplantation in patients with refractory lymphoid malignancies［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2012，18(11):1677-1686.

［5］ She M，Niu X，Chen X，et al. Resistance of leukemic stem-like cells in AML cell line KG1a to natural killer cell-mediated cytotoxicity［J］. Cancer Lett，2012，318(2):173-179.

［6］ 徐霜清，祝愛珍，劉成成，等.鹽霉素抑制耐格列衛的人慢性粒細胞白血病細胞株K562/Glv 增殖并誘導其凋亡［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7):1208-1212.

［7］ 郭坤元，姚開泰.以腫瘤干細胞為靶的免疫治療［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2012，19(3):343-347.

［8］ Giovannetti E，Mey V，Loni L，et al. Cytotoxic activity of gemcitabine and correlation with expression profile of drugrelated genes in human lymphoid cells［J］. Pharmacol Res，2007，55(4):343-349.