槲皮素對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠肺泡中性粒細胞凋亡的影響

徐曉武， 楊小敏， 金洲祥， 李利義， 朱少俊

(1溫州醫學院附屬第二醫院普外科，浙江 溫州325027;2溫州市第三人民醫院病理科，浙江 溫州325000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是重癥急性 胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)時胰外最常見的并發癥，臨床上發生率高達70%［1］，相當一部分患者進展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，是患者早期死亡的主要原因［2-3］。ALL 時大量的中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在肺泡聚集，并且由于局部炎癥介質的作用使PMN 發生凋亡延遲，凋亡延遲的PMN 在炎癥部位通過呼吸爆發產生大量自由基、蛋白水解酶及炎癥介質等有害物質造成組織損傷，增加肺組織的炎癥反應，從而導致加重肺損傷［4］。槲皮素(quercetin，Que)是一種黃酮類化合物，具有清除氧自由基、抗炎、調節免疫功能、降血壓、減輕心肌缺血/再灌注損傷、鈣拮抗和蛋白激酶C 抑制等多種生物學活性。有研究表明槲皮素對內毒素延遲中性粒細胞凋亡效應具有抑制作用［5］，但對急性胰腺炎伴發肺損傷時肺組織中性粒細胞凋亡有何影響，尚缺乏深入研究，本實驗研究槲皮素對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠肺泡中性粒細胞凋亡的影響及機制，為槲皮素在重癥急性胰腺炎肺損傷中的應用提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑、儀器及動物

槲皮素(Sigma)，Percoll 分離液(Pharmacia)，RPMI-1640(Gibco)，caspase-3 活性檢測試劑盒(Promega)，Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Sigma)，Bradford 蛋白質定量檢測試劑盒(上海生工生物技術有限公司)，兔抗Bax 單克隆抗體、兔抗Bcl-2 單克隆抗體、兔抗β-actin 單克隆抗體和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京中杉金橋生物工程有限公司)。FACSCalibur 流式細胞儀(BD)，牛磺膽酸鈉(Sigma)，REVCO 二氧化碳培養箱(Asheville)，高速冷凍離心機MR23i(Jouan)，Elx808 全自動酶標儀(Bio-Tek)。其它試劑均為國產分析純。清潔級SD 大鼠48 只(購自溫州醫學院動物實驗中心)，體重200 ～250 g，雌雄不拘。

2 動物模型與分組

清潔級SD 大鼠48 只(購自溫州醫學院動物實驗中心)，體重200 ～250 g，雌雄不拘，隨機分為sham組、SAP 組、槲皮素低劑量組及槲皮素高劑量組，每組12 只。Sham 組僅行開關手術，胰腺炎組經膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(2 mL/kg)制作SAP 模型。槲皮素組在SAP 模型基礎上予槲皮素干預，槲皮素溶于二甲亞砜溶液中，在注射制模前30 min 腹腔注射(分別為50 mg/kg 和100 mg/kg)。Sham 組和SAP 組給予等量生理鹽水。術后24 h 處死大鼠，支氣管肺泡灌洗分離收集肺泡PMN，取胰腺和肺標本送檢。

3 支氣管肺泡灌洗分離收集肺泡PMN

術后24 h 頸動脈放血處死大鼠，參照文獻［6-7］分離收集肺泡PMN，將動物麻醉后，切開氣管插管，行肺泡灌洗，注入25 mL PBS。總回收率為90.52%。將支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)離心(1 300 r/min)。沉淀的細胞涂片、瑞氏染色，高倍鏡下計數200 個細胞進行分類。將BALF中沉淀的細胞用PBS 清洗后，用密度梯度離心液Percoll(密度分別為1.085 和1.095)分離肺泡PMN。

4 PMN 形態學觀察

將肺泡PMN 接種在蓋玻片上(1 ×109/L)，4%多聚甲醛4 ℃固定5 min，PBS 洗3 次后，點加Hoechst 33258 染色液(10 mg/L)，室溫孵育10 min，PBS洗片3 次后，用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。

5 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測肺泡PMN 凋亡指數

將肺泡PMN 用冰PBS 緩沖液沖洗后，懸浮于結合液中，調整濃度至1 ×109/L。取445 μL 液體加5 μL Annexin V-FITC 及50 μL PI(100 mg/ L)，室溫下黑暗處孵育15 min，FACSCalibur 流式細胞儀檢測，同時以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作為陰性對照。Annexin V/PI 雙坐標圖上散點圖右下象限即Annexin V+/PI-細胞，為凋亡細胞，以占所有細胞的百分數表示PMN 的凋亡指數。

6 Western blotting 檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達

細胞裂解液裂解細胞，Bradford 法測定蛋白濃度，取總蛋白20 μg 加樣，經15%SDS-PAGE 電泳后，電轉移半干轉法將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上;含5%脫脂奶粉PBS 溶液封閉，4 ℃孵育過夜。次日復溫1 h;棄去牛奶，加入Bax 和Bcl-2多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜;PBS 洗膜3 次，每次15 min;應用辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶200)室溫孵育1 h;PBS 洗膜3 次，每次15 min;熒光試劑盒顯影曝光，采用Quantity One 軟件進行圖像灰度分析，計算Bax 和Bcl-2 與β-actin 的灰度比值，以表示Bax 和Bcl-2 的相對表達量。

7 檢測caspase-3 活性

將細胞以1 ×108/L 濃度接種于96 孔板，每孔100 μL，獨立重復5 次，以不加藥組為空白對照，每孔加入混合后的caspase-3 試劑100 μL，孵育3 h 后取出96 孔板，檢測熒光分光光度計波長405 nm 處的吸光度值，空白孔作對照，計算實驗組吸光度與對照組吸光度的比值，確定活化程度。

8 組織學檢查

將各組大鼠的肺組織標本常規固定、包埋、HE染色，病理醫師單盲閱片，按Osman 等［8］的標準進行肺組織學評分。

9 統計學處理

結 果

1 PMN 形態學觀察

Hoechst 33258 染色顯示，sham 組見較多的肺泡PMN 凋亡，凋亡的肺泡PMN 表現為染色質凝集，細胞核變小，細胞核呈固縮狀或斑塊狀;與sham 組比較，SAP 組凋亡的PMN 顯著減少;槲皮素預處理后凋亡細胞數目較SAP 組增加，見圖1。

2 流式細胞術檢測PMN 凋亡指數

Sham 組肺泡PMN 凋亡指數為23.28%，SAP 組肺泡PMN 凋亡指數為7.32%，較sham 組明顯降低(P ＜0.01);Que 組肺泡PMN 凋亡指數為16.13%，較SAP 組明顯增高(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 1. Effects of quercetin (Que)on morphology of alveolar polymorphonuclear neutrophils from severe acute pancreatitis (SAP)rats. A:sham;B:Que at high dose;C:Que at low dose;D:SAP group.圖1 槲皮素對肺泡PMN 形態學改變的影響

Figure 2. Effects of Que on apoptosis of alveolar polymorphonuclear neutrophils from SAP rats. A:sham;B:Que at high dose;C:Que at low dose;D:SAP group.圖2 槲皮素對肺泡PMN 凋亡的影響

3 檢測肺泡PMN caspase-3 活性

Sham 組、Que 高劑量組、Que 低劑量組及SAP 組的450 nm 吸光度值分別為:0.250 ±0.042、0.190 ±0.028、0.160 ±0.026 及0.110 ±0.032。與sham 組比較，SAP 組caspase-3 活性明顯降低(P ＜0.01)，與SAP 組比較，Que 組caspase-3 活性增強(P ＜0.01)，且呈劑量依賴性(P ＜0.01)。

4 Western blotting 檢測肺泡PMN Bax 和Bcl-2 蛋白的表達

Western blotting 結果顯示，與sham 組比較，SAP組Bax 蛋白表達減弱，Bcl-2 蛋白表達增強(P ＜0.01)，與SAP 組比較，Que 組Bax 蛋白表達明顯增強，Bcl-2 蛋白表達減弱(P ＜0.05)，見圖3、表1。

Figure 3. Effects of Que on Bax and Bcl-2 protein expression in alveolar polymorphonuclear neutrophils from SAP rats.1:sham;2:Que at high dose;3:Que at low dose;4:SAP group.圖3 各組肺泡PMN Bax 和Bcl-2 蛋白的表達

表1 槲皮素對肺泡PMN Bax 和Bcl-2 蛋白表達的影響Table 1. Effects of Que on Bax and Bcl-2 protein expression in alveolar polymorphonuclear neutrophils from SAP rats(±s.n=12)

表1 槲皮素對肺泡PMN Bax 和Bcl-2 蛋白表達的影響Table 1. Effects of Que on Bax and Bcl-2 protein expression in alveolar polymorphonuclear neutrophils from SAP rats(±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs SAP;△△P ＜0.01 vs Que at low dose.

Group Bax Bcl-2 Sham 0.400±0.064 0.250±0.023 Que at high dose 0.310±0.033＊＊##△△ 0.280±0.019##△△Que at low dose 0.260±0.052＊＊# 0.340±0.014＊＊SAP 0.210±0.035＊＊ 0.370±0.011＊＊

5 肺組織鏡下病理評分結果

Sham 組未見明顯病理改變;SAP 組可見肺間質中小血管擴張，肺泡腔內有炎癥滲出物及淋巴細胞浸潤;Que 組未見明顯擴張血管，炎性滲出物及淋巴細胞浸潤減輕，見圖2。Sham 組、Que 高劑量組、Que低劑量組及SAP 組評分的平均秩次分別為:6.54、18.46、30.50 及42.50。與sham 組比較，SAP 組評分的平均秩次明顯升高(P ＜0. 01)，與SAP 組比較，Que 組評分的平均秩次明顯降低(P ＜0.01)。

討 論

Figure 4. Effects of Que on pathological alteration of lung tissues in SAP rats(HE staining，×400). A:sham;B:Que at high dose;C:Que at low dose;D:SAP group.圖4 槲皮素對大鼠肺組織病理學改變的影響

急性肺損傷是重癥急性胰腺炎患者早期死亡的主要原因。Grommes 等［9］研究表明，PMN 凋亡延遲且過度活化可能是肺損傷的重要途徑。PMN 的缺失可以減輕由胰腺炎引起的肺損傷［10］。PMN在循環系統中存活6 ～8 h，以細胞凋亡的形式清除。正常條件下，激活的PMN 在病原體消除后很快就會被機體清除，但是某些炎癥因子如LPS、TNF-α、IL-8、IL-6、GM-CSF 抑制PMN 的凋亡。凋亡延遲導致PMN在ALI 發生過程中向肺組織聚集。ALI/ARDS 時PMN 在肺毛細血管內大量黏附、聚集，繼之游出肺血管床，移至肺泡腔，并持續活化，一方面通過釋放活性氧、蛋白酶及脂類代謝產物等炎癥介質直接損傷肺組織;另一方面通過激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)誘導IL-1β、IL-8、TNF-α 等促炎癥細胞因子的釋放引起瀑布效應，在炎癥部位生存時間明顯延長。

本研究發現，SAP 組PMN 凋亡指數降低，Bax 蛋白表達減弱，Bcl-2 蛋白表達增強，caspase-3 活性減弱(P ＜0.01);而槲皮素預處理后PMN 凋亡指數升高，Bax 蛋白表達增強，Bcl-2 蛋白表達減弱，caspase-3 活性增強。提示SAP 時PMN 凋亡延遲且持續活化，導致大量炎癥介質釋放，加重肺損傷。調控細胞凋亡的基因可分為凋亡促進基因和凋亡抑制基因兩類。bcl-2 基因屬于bcl-2 家族基因，是最重要的細胞凋亡抑制基因。bax 是bcl-2 家族中重要的細胞凋亡誘導基因，其編碼蛋白氨基酸序列有21%與Bcl-2 同源，Bax 可與Bcl-2 形成同源或異源二聚體，具有抑制Bcl-2、促進細胞凋亡的作用。Bcl-2 與Bax 兩者之間的比例決定了細胞的命運，若Bax 占多數，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導，細胞死亡;反之則Bax 受到抑制，細胞得以生存［11］。

Caspase 是一組以天冬氨酸為底物的半胱氨酸蛋白酶家族，其家族成員在細胞凋亡過程中起著關鍵作用［12］。Caspase 高表達可誘發細胞凋亡的發生，其中caspase-3 是細胞凋亡過程中的主要效應因子。又是多種凋亡途徑共同作用的因子，其表達水平的高低決定著細胞凋亡程度［13］。因此，本研究采用熒光分光光度計法檢測caspase-3 活性，SAP 組caspase-3 活性減弱(P ＜0.01);而槲皮素預處理后caspase-3活性增強。因此，槲皮素能誘導PMN 發生凋亡，激活caspase-3 是其中機制之一。

總之，槲皮素通過上調Bax 蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，增強caspase-3 活性，誘導PMN 發生凋亡，減輕SAP 大鼠肺損傷。具體機制有待進一步研究，深入研究其作用機制將有助于減輕SAP 引起的肺損傷，降低早期死亡率。

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