葡萄糖調節蛋白78 在大鼠肝肺綜合征肺微血管重構中的作用*

賈建桃， 張慧英△， 郭建紅， 李 晨， 呂敏麗，張麗麗， 張翠英， 李寶紅， 趙中夫， 韓德五， CHENG Ji

(1 長治醫學院病理生理學教研室，山西 長治046000;2山西醫科大學肝病研究所，山西 太原030001;3長治醫學院生理學教研室，山西 長治046000;4山西醫科大學第二醫院ICU，山西 太原030001;5長治醫學院肝病研究所，山西 長治046000;6美國南加州大學KECK 醫學院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉磯90089)

肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是肝硬化早期出現的一種肺微血管紊亂性疾病［1］，一旦發生，即可加重原發肝臟疾病并促進其它并發癥的發生。葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)不僅是內質網應激的標記分子［2］，而且其高表達也與多種疾病的發生密切相關［3］。我們前期工作已經證實，HPS 大鼠肺微血管數量隨病程進展逐漸增多［4］;肝硬化時形成的腸源性內毒素血癥作為內質網應激的重要應激原，激活肺組織的內質網應激反應導致GRP78 表達增高，很可能是HPS發病的關鍵因素［5］。由于GRP78 過表達在多種疾病發生中具有促增殖和抑凋亡作用［6-7］，由此，我們推測在HPS 發病中，高表達的GRP78 也可能是通過該種機制導致了肺微血管的重構。本項研究通過觀察復合致病因素誘導的肝硬化合并HPS 大鼠發病過程中肺組織GRP78 以及肺微血管增生和凋亡相關因子的表達變化，探討GRP78 對肺微血管重構的作用機制，為臨床HPS 以及其它并發癥的預防和治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 Wistar 清潔級大鼠，由山西醫科大學動物實驗中心供應。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠GRP78 多克隆抗體購自Sigma;血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)/生長阻滯及DNA 損傷誘導蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)多克隆抗體購自Santa Cruz;caspase-12、核因子(nuclear fator，NF)-κB 、Bcl-2 和Ⅷ因子相關抗原(factor Ⅷ-related antigen，FⅧ-RAg)多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司;鼠抗兔3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG 均購自碧云天生物技術研究所;SuperECL Plus 超敏發光液和BCA 法蛋白定量試劑盒購自普利萊基因技術有限公司;Trizol 試劑盒和RT-PCR 試劑盒購自Gibco;TaqDNA 聚合酶購自Promega;VEGF 和GAPDH 引物由生物工程上海有限公司合成。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立 雄性Wistar 大鼠，體重200 ～240 g，隨機分為4 周、6 周、8 周3 個時點組，每個時點組隨機分為正常對照組和模型組。對照組動物給予標準飼料和飲用礦物質水，模型組動物用復合致病因素法復制肝硬化合并HPS 模型［4-5］。分別于各時點，全麻、無菌、無內毒素條件下經腹主動脈采集血液，3 000 r/min 離心15 min，吸取血漿，－70℃保存備用;取部分肝組織和肺組織立即置于液氮中保存備用，其余組織用中性甲醛緩沖液固定，用于組織學研究。

2.2 免疫組化法檢測肺組織GRP78、FⅧ-RAg、CHOP/GADD153、caspase-12、Bcl-2 和NF-κB 的表達

以石蠟包埋的肺組織標本制備4 μm 切片，經脫蠟、水化和抗原修復處理后，采用SP 法，遵照說明書進行(Ⅰ抗分別為兔抗大鼠GRP78、F Ⅷ-RAg、GADD153、caspase-12、Bcl-2 和NF-κB 多 克 隆 抗體)，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片、鏡檢。用PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。棕黃色顆粒為染色陽性顆粒，采用BI-2000 醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)，在光學顯微鏡下每張切片隨機取10 個視野，分別計算細胞平均吸光度值(NF-κB 分別計數每個視野中胞漿陽染細胞和胞核陽染細胞占總細胞的百分比)，取平均值進行統計學分析。

2.3 RT-PCR 法檢測肺組織中VEGF mRNA 的表達

取肺組織100 mg，提取總RNA，紫外分光光度計檢測波長為260 nm 和280 nm 時的吸光度(A)，兩者的比值代表RNA 純度及濃度。取50 μg 總RNA 按照說明書進行逆轉錄和擴增。VEGF 引物序列上游引物5'-CTG CTC TCT TGG GTG CAC TG-3'，下游引物5'-CTG CGG ATC TTG GAC AAA CA-3'，擴增片段長度465bp;GAPDH 為內參照，上游引物5'-GGT CAT CAA CGG GAA ACC C-3'，下游引物5'-TCT GAG TGG CAG TGA TGG CA-3'，擴增片段長度450 bp。擴增參數:95 ℃預變性2 min，95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，進行30 個循環，最后72 ℃5 min。DNA標準(D12000)確定PCR 產物大小，經2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀上進行光密度掃描并采用Quantity One 凝膠分析系統(Bio-Rad)測定目的條帶與GAPDH 條帶的吸光度，以兩者的比值表示目的mRNA 的相對含量。

2.4 Western blotting 法檢測肺組織中VEGF 的表達

取肺組織超聲裂解后，BCA 法蛋白定量。取150 μg 蛋白，變性，上樣，經10% SDS-PAGE 凝膠電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜，封閉后加入兔抗大鼠VEGF 多克隆抗體(1∶800 稀釋)4 ℃過夜，洗滌后加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶800 稀釋)室溫1 h，洗滌后加ECL 超敏發光液，X 線膠片曝光、顯影。以GAPDH 為內參照。采用分子生物學圖像分析系統進行定量掃描測定條帶灰度值，將每個樣本的灰度值與相應GAPDH 的灰度值相比，計算蛋白的表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，單因素方差分析法比較多個樣本均數，采用LSD-t 檢驗法進行均數之間的兩兩比較，線性相關法分析兩兩指標間的相關性，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織中GRP78、FⅧ-RAg、CHOP/GADD153、caspase-12、Bcl-2 和NF-κB 的表達

免疫組織化學結果顯示，GRP78 和FⅧ-RAg 在胞漿和胞膜上均有表達，胞核未見著色;模型組兩者染色強度和數量均隨病程進展逐漸升高并顯著高于對照組，GRP78 在8 周組顯著高于4 周組(P ＜0.05)，FⅧ-RAg 8 周組與4 周和6 周組均有顯著差異(P ＜0.05)。CHOP/GADD153 和caspase-12 在胞漿中表達;模型組兩者染色強度和數量隨病程進展逐漸降低，8 周組CHOP/GADD153 顯著低于4 周和6 周組(P ＜0.05)，caspase-12 在6 周和8 周組明顯低于4 周組(P ＜0.05)。Bcl-2 在胞漿中表達;模型組染色強度和數量隨病程進展呈增高趨勢，且明顯高于正常對照組(P ＜0.05)。NF-κB 在正常對照組僅有少量表達，模型組隨病程進展逐漸增多，尤其以胞核的表達增加明顯，見圖1 ～6 和表1 ～3。

2 肺組織中VEGF mRNA 和蛋白的表達

模型組VEGF mRNA 表達在4 周組和6 周組顯著高于正常對照組(P ＜0.05);蛋白的表達隨病程進展而逐漸增加(P ＜0.05)，見圖7、8。

Figure 1. The expression of GRP78 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖1 HPS 大鼠肺組織GRP78 蛋白表達變化

Figure 2. The expression of FⅧ-RAg protein in lung tissues detected by immunohistochemistry(×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖2 HPS 大鼠肺組織FⅧ-RAg 蛋白表達變化

Figure 3. The expression of CHOP/GADD153 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400).A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖3 HPS 大鼠肺組織CHOP/GADD153 蛋白表達變化

Figure 4. The expression of caspase-12 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖4 HPS 大鼠肺組織caspase-12 蛋白表達變化

Figure 5. The expression of Bcl-2 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖5 HPS 大鼠肺組織Bcl-2 蛋白表達變化

Figure 6. The expression of NF-κB protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×1 000). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖6 HPS 大鼠肺組織NF-κB 蛋白表達變化

表1 各時點對照組和模型組HPS 大鼠肺組織GRP78、FⅧ-RAg 和CHOP/GADD153 水平變化Table 1. Content of GRP78，FⅧ-RAg and CHOP/GADD153 of lung tissue in control and HPS groups(mean±SD)

表2 各時點對照組和模型組HPS 大鼠肺組織caspase-12 和Bcl-2 水平變化Table 2. Content of caspase-12 and Bcl-2 of lung tissue in control and HPS groups(mean±SD)

表3 各時點對照組和模型組HPS 大鼠肺組織NF-κB 水平變化Table 3. Content of NF-κB of lung tissue in control and HPS groups(mean±SD)

Figure 7. The mRNA level of VEGF in rat lung tissues from control and HPS groups. 1:control at the 4th week;2:HPS at the 4th week;3:control at the 6th week;4:HPS at the 6th week;5:control at the 8th week;6:HPS at the 8th week. Mean±SD. * P ＜0.05 vs control.圖7 大鼠肺組織VEGF mRNA 的表達

3 相關性分析

肺組織GRP78 蛋白表達水平與肺組織VEGF(r=0.7750，P ＜0.01)和FⅧ-RAg 蛋白(r =0.7824，P ＜0.01)的表達呈正相關，與CHOP/GADD153(r =－0.6921，P ＜0.01)和caspase-12(r=－0.7012，P ＜0.01)的表達呈負相關。

討 論

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是細胞內重要的細胞器，內毒素［5］、缺氧和Ca2+紊亂等是引起ER 應激(ER stress，ERS)的重要應激原，并啟動內質網應激反應信號通路:(1)通過減少蛋白質的翻譯，阻止未折疊蛋白進一步積聚;(2)上調分子伴侶GRP78 和GRP94 蛋白以及有利于蛋白折疊和恢復內環境功能的各種蛋白的基因表達，增強蛋白折疊能力，在后期則通過泛素－蛋白酶體系統清除誤折疊蛋白;(3)免疫和抗凋亡介質NF-κB 激活;(4)內質網功能嚴重受損時，啟動凋亡途徑清除損傷細胞，包括CHOP/GADD153 的轉錄激活、c-Jun 氨基端激酶通路的激活和內質網相關凋亡蛋白酶caspase-12的激活［8］。在不同病理情況下，依據ERS 的程度，促細胞生存和促細胞凋亡信號相互作用，最終決定細胞的存亡［9-11］。本項研究中，HPS 動物肺組織中內質網應激相關信號分子GRP78、caspase-12、GADD153和NF-κB 的變化，進一步證明了內質網應激在HPS發病中的重要作用。

Figure 8. The protein level of VEGF in rat lung tissues from control and HPS groups. 1:control at the 4th week;2:HPS at the 4th week;3:control at the 6th week;4:HPS at the 6th week;5:control at the 8th week;6:HPS at the 8th week. Mean ±SD. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs 4th week;#P ＜0.05 vs 6th week.圖8 大鼠肺組織VEGF 蛋白的表達

肺微血管重構是肝肺綜合征發病的中心環節。FⅧ-RAg 是特異性血管標記物，其含量的變化可較為直觀地反映血管密度。VEGF 不僅具有特異性促血管內皮細胞增生和血管生成的特征，而且還具有改變細胞外基質的作用，是生理和病理過程中多數因子促進血管重構的共同通路。研究證實，GRP78可以直接或者通過VEGF 促進血管增生［12-13］。本項研究中，肺組織中FⅧ-RAg 及VEGF 蛋白表達隨病程進展逐漸升高，而且增高的GRP78 蛋白與升高的VEGF 和FⅧ-RAg 分別呈正相關。表明在HPS 發病過程中，GRP78 很可能是引起肺微血管重構的關鍵因子。

血管內皮細胞增殖和凋亡的力量對比是決定血管增生程度的重要機制。GRP78 具有正向和負向雙重調節細胞生長的作用［3，14］。生理情況下，GRP78在胞漿中表達，發揮促進細胞凋亡、抑制血管增殖的作用［2］;病理情況下，GRP78 在胞漿中表達異常增高，并轉運至胞膜作為受體發揮刺激細胞增殖、抑制凋亡和促進新血管生成等作用［2，6-7］。GRP78 的促增殖作用是通過與多種胞外配體(如activated α2-macroglobulin 和Kringle 5 等)或內皮細胞表面錨定蛋白(如表皮生長因子家族的Cripto 蛋白)形成復合物而發揮的［7］。GRP78 也可以通過活化NF-κB 促進細胞增殖，這種作用是通過Bcl-2 抗凋亡途徑、MAPK 信號通路和PI3-激酶通路所發揮的［15］。目前認為GRP78 可能的抑凋亡機制如下，通過其自身的ATP結構域與caspase-7 和caspase-12 形成復合物，阻止caspase-12 的釋放［16-17］;下調活化轉錄因子6 或蛋白激酶R 樣內質網激酶通路，減少CHOP/GADD153 的產生;對抗Bcl-2 家族中促凋亡蛋白的作用［18］。此外，Bcl-2 家族中具有抗凋亡作用的Bcl-2 等分子還可以下調CHOP/GADD153 而發揮抗凋亡作用［19-20］。本研究觀察到在HPS 發病過程中，GRP78 表達逐漸增高，與表達逐漸減少的caspase-12 和CHOP/GADD153 顯著相關，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達逐漸增高，NF-κB 活化，說明在HPS 發病過程中，GRP78 的高表達很可能是通過VEGF 途徑促進細胞增殖和通過阻止caspase-12 釋放以及減少CHOP 表達抑制凋亡，促進了肺微血管的重構。

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