環磷酰胺節拍化療聯合重組人血管內皮抑制素對非小細胞肺癌移植瘤裸鼠的影響及其機制研究

汪 蕊， 秦叔逵， 陳余清， 吳 窮， 楊 燕， 李玉梅， 汪子書， 鄭榮生

(蚌埠醫學院第一附屬醫院1腫瘤內科，3呼吸科，安徽 蚌埠233004;2南京八一醫院全軍腫瘤中心腫瘤內科，江蘇 南京210002)

肺癌在癌癥相關死亡中位居首位［1］，其中，非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)約占80%。對于非選擇性的晚期NSCLC 患者而言，含鉑的兩藥方案化療是標準的一線治療［2］。然而，系統化療的療效已經達到平臺期，長程化療并未帶來總生存期(overall survival，OS)的額外獲益［3］。目前，對于晚期NSCLC 初始治療有效的病人，臨床上推薦進行維持治療，有效的維持治療延長了病人的無進展生存期(progress-free survival，PFS)和OS，并能控制癥狀和改善生活質量［4］。例如，在4 ～6 周期化療后，對治療有效的病人轉換成培美曲塞或厄洛替尼維持治療有確定的PFS 和OS 獲益［5-6］。但是，不同的維持治療在療效上卻不盡相同［7-8］。因此，有必要探索更多安全有效的維持治療方法。本研究在肺腺癌裸鼠皮下移植瘤模型上，考察了最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)的環磷酰胺(cyclophosphamide，CPA)化療后，轉換成CPA 節拍化療(metronomic chemotherapy，MET)、重組人血管內皮抑制素治療(recombinant human endostatin，Endostar/Endo)以及2 種方法聯合使用作為維持治療的療效和抗血管形成機制，探索一種新的晚期NSCLC 維持治療模式。

材 料 和 方 法

1 動物和藥物

SPF 級BALB/c 裸鼠，雌性，4 周齡，16 ～18 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證為SCXK(滬)2007-005。人肺腺癌細胞系A549 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。Endostar購自江蘇先聲藥業有限公司，CPA 購自International Laboratory。

2 主要試劑

DMEM 液體培養基和胎牛血清購自Gibco;7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)細胞活性染色液、熒光抗體APC anti-mouse CD45、PE antimouse CD146、APC-rat-IgG2b、PE-rat-IgG2a、goat antimouse CD31 和DAPI 購自BioLegend;Rabbit antimouse NG2、chicken anti-goat IgG-TRITC 和donkey anti-rabbit IgG-FITC 購自Abcam。

3 動物研究方案

A549 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。細胞處于對數生長期時，用0.25%胰酶消化細胞制成細胞懸液，濃度為1 ×1010/L。在裸鼠的右側背部皮下接種0.25 mL(2.5 ×106)細胞懸液。移植瘤體積長至150 ～250 mm3時，腹腔注射給藥MTD CPA(CPA 100 mg/kg，第1、3、5 d 分別腹腔注射給藥1次，21 d 為1 周期)。藥物干預4 個周期后隨機分為4 組，轉換成以下治療:生理鹽水(生理鹽水0.2mL，每天腹腔注射給藥，control 組)、MET CPA 維持治療(CPA 10 mg/kg，每天灌胃給藥，MET CPA 組)、Endo維持治療(Endostar 4 mg/kg，每天腹腔注射給藥，Endo 組)和MET CPA+Endo 維持治療(藥物劑量和給藥途徑同MET CPA 和Endo 組，MET CPA + Endo組)。每3 d 測量移植瘤最長徑(length，L)和最短徑(width，W)，計算移植瘤體積(volume，V;V =0.52 ×L×W2)。記錄動物的生存期。本研究方案經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

4 外周血循環內皮細胞(circulating endothelial cells，CECs)和存活CECs(viable CECs)的測定

在維持治療第6 周時，每組隨機選取8 只荷瘤鼠，分別獲取外周血50 μL，肝素鈉抗凝，混勻，加入2 mL 溶血素，室溫避光孵育20 min。加入1 μL CD45-APC(1∶10)、1 μL CD146-PE(1∶10)和10 μL 7-AAD(1∶10)至流式管中，對照管加入1 μL IgG2b-APC(1∶10)和1 μL IgG2a-PE(1∶10)，混勻，室溫避光孵育20 min，1 500 r/min 離心5 min，倒去上清，加入2 mL 緩沖液洗滌，1 500 r/min 離心5 min，加入100 μL 緩沖液。BD 公司FACScalibur 型流式細胞術測定外周血CECs 和存活CECs。

5 免疫熒光染色

處死取血后的荷瘤鼠(每組8 只)，剝離瘤體。在含10%中性甲醛溶液4 ℃固定1 h，浸泡于4 ℃30%蔗糖PBS 液中直至沉底。用OCT 包埋劑進行包埋后冰凍，制成4 μm 切片。從每例標本的20 張切片中選取5 張不連續切片進行免疫熒光染色。步驟如下:含10%血清PBS 室溫封閉切片1 h，加入goat anti-mouse CD31(1 ∶50)、rabbit anti-mouse NG2(1∶50)單克隆抗體及同型對照4 ℃孵育過夜。PBS洗滌(3 ×10 min)，加入熒光素標記的chicken antigoat IgG-TRITC(1 ∶100)和donkey anti-rabbit IgGFITC(1∶100)Ⅱ抗37 ℃孵育1 h。PBS 洗滌(3 ×10 min)，加入含DAPI(10 mg/L)的抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片［9］。激光共聚焦顯微鏡(×100 倍)觀察切片血管密集區域，并在高倍(×400 倍)鏡下計數微血管數(CD31 標記的血管結構);管周細胞覆蓋率為管周細胞(NG2 標記)覆蓋血管內皮(CD31 標記)周徑(橫切面)或長度(縱切面)的百分比。每張切片隨機選取5 個視野計算微血管密度(microvessel density，MVD)及管周細胞覆蓋率。

6 統計學處理

用SPSS 13.0 軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗，生存分析使用log-rank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 移植瘤生長情況

裸鼠接種7 ～10 d 后形成瘤結節，成瘤率為100%。在維持治療第6 周時，MET CPA 和Endo 組腫瘤體積顯著小于control 組(P ＜0.05)，MET CPA+Endo組腫瘤體積又顯著小于單藥維持治療組(P ＜0.05)，見圖1。

2 CECs 和存活CECs 測定結果

應用CellQuest 軟件獲取10 000 個細胞進行分析，計算CD45－CD146+細胞和CD45－CD146+7-AAD－細胞占R1 門內細胞的百分比，見圖2。結果顯示MET CPA 組和Endo 組外周血CECs 顯著低于control 組(P ＜0. 01)。在存活CECs指標上，MET CPA 組和Endo 組也顯著低于control 組(P ＜0.01)。MET CPA+Endo 組在外周血CECs 和存活CECs 上又顯著低于單藥維持治療組(P ＜0.05)。

Figure 1. The tumor volume in BALB/c nude mice at the 6th week of maintenance treatment. Mean±SD. n=22 in control group;n =23 in MET CPA，Endo and MET CPA+Endo groups. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs MET CPA+Endo.圖1 維持治療第6 周時荷瘤鼠移植瘤的體積

3 腫瘤MVD 測定結果

移植瘤的微血管熒光染色見圖3。結果表明MET CPA 組(18. 34 ± 2. 37)和Endo 組(20. 08 ±1.99)腫瘤組織MVD 較control 組(28.83 ±2.05)顯著減少(P ＜0.01);MET CPA + Endo 組(10.71 ±2.39)與單藥維持組比較則進一步減少(P ＜0.05)。

4 管周細胞覆蓋率

移植瘤血管的管周細胞覆蓋見圖4。在管周細胞覆蓋率上，Endo 組(60.39% ±11.44%)顯著低于control 組(68.23% ±11.05%;P ＜0.05)，MET CPA+Endo 組(42.05% ±13.63%)較Endo 組又被進一步下調(P ＜0.05)。MET CPA 組(65.64% ±11.81%)較control 組有下降的趨勢，但差異無統計學意義(P ＞0.05)。在荷瘤鼠正常肝臟組織中，血管管周細胞覆蓋率在各治療組間無顯著差異(圖略)。

5 荷瘤鼠生存期

在截尾分析時，模型鼠生存曲線見圖5。在中位OS 上，MET CPA 組(107.00 d ±14.17 d)和Endo組(109.00 d ± 10.63 d)較control 組(72.00 d ±12.88 d)顯著延長(P ＜0.05)。MET CPA +Endo 組OS(154.00 d±8.37 d)較Endo 和MET CPA 組進一步延長(P ＜0.05)。

Figure 2. The peripheral blood CECs and viable CECs detected by flowcytometry. Mean ±SD. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs MET CPA+Endo.圖2 流式細胞術分析外周血CECs 和存活CECs

Figure 3. Tumor microvessel density in the four groups observed by confocal microscopy (× 400). The microvessel density in xenograft tumors was determined by immunofluorescence marked by CD31.圖3 共聚焦顯微鏡觀察移植瘤微血管密度

Figure 4. Confocal microscopic images showing the pericyte coverage in xenograft tumors in the four groups (×400).Fluorescence images of tumors showed CD31-positive endothelial cells (red)， NG2-positive pericytes(green)，and DAPI-positive nuclei (blue).圖4 共聚焦顯微鏡分析移植瘤管周細胞覆蓋率

Figure 5. Survival curves of mice bearing xenograft tumors in the four groups. n =14 in control group;n =15 in MET CPA，Endo and MET CPA + Endo groups. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs MET CPA+Endo.圖5 荷瘤鼠生存曲線

討 論

對于一線化療有效的晚期NSCLC，維持治療可以獲得生存期利益，但并非所有的維持治療均有臨床獲益，因此，有必要探索新的維持治療方法［10－11］。我們曾在肺腺癌細胞A549 移植瘤的動物模型上，發現CPA 節拍化療聯合血管形成抑制劑Endostar 能產生增強的抗腫瘤作用，并改善了模型動物的生存期，這種療效可能與兩藥聯合使用具有抗血管形成的增效作用有關［12］。本研究在相同模型上，考察了大劑量CPA 化療4 個周期后，CPA 節拍化療聯合Endostar 作為維持治療的療效和抗血管形成機制。結果表明在維持治療第6 周時，CPA 節拍化療和Endostar 單藥抑制腫瘤生長優于生理鹽水對照組，而兩藥聯合使用則產生了增強抗腫瘤和改善生存期的作用?？梢姡珻PA 節拍化療聯合Endostar 有成為晚期NSCLC 維持治療的潛在價值，這種增效作用可能與聯合用藥能產生抗血管形成增效作用有關，表現為聯合用藥較單藥維持治療進一步下調了外周血CECs、MVD 和管周細胞覆蓋率。

新生血管形成在腫瘤生長和擴散中扮演著關鍵角色，其過程涉及到腫瘤細胞、血管內皮細胞、基質細胞和管周細胞之間的交互作用［13］。研究表明富血管腫瘤中MVD 和管周細胞覆蓋明顯增多，并且與預后不良相關［14］。Endostar 通過抑制VEGF 信號通路發揮抗腫瘤血管形成作用［15-16］。例如，Endostar 在血管內皮細胞中能阻斷VEGF 誘導的VEGFR2 表達和磷酸化，并抑制VEGFR 信號通路下游的多個蛋白激酶的活性［17］。VEGF 抑制劑也能阻斷G 蛋白信號轉導調節因子5 (regulator of G-protein signaling 5，RGS5)表達而下調新生血管的管周細胞覆蓋［18］。節拍化療有確定的抗血管形成作用。例如，CPA 節拍化療顯著增加血管內皮細胞中血小板反應蛋白1(thrombospondin 1，TSP1)的表達，后者是內源性的血管形成抑制劑［19］。CPA 節拍化療也能下調外周血中VEGF 和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等促血管形成因子的水平，后者在介導管周細胞穩態中發揮重要作用［20-22］。因此，聯合使用CPA 節拍化療和Endostar 有可能在多個環節上產生增強的抗腫瘤血管形成作用，這與其它血管形成抑制劑聯合節拍化療的研究結果是一致的。在本研究中，使用CPA 節拍化療與Endostar 進行維持治療降低了腫瘤的MVD，而Endostar 又顯著降低了管周細胞覆蓋，兩藥聯合則進一步降低了MVD 和管周細胞覆蓋率，這些作用有可能轉化成對腫瘤生長的抑制作用和生存期獲益。同時，我們也測定了模型動物肝臟組織血管的管周細胞覆蓋情況，在不同治療組間并未發現顯著差異，說明CPA 節拍化療和Endostar 只影響腫瘤組織中新生血管的形成。

在抗腫瘤血管形成治療時，CECs 被認為是療效替代指標［22-23］。目前，至少有2 種CECs 能被鑒定，即骨髓起源的前體CECs 和成熟的CECs。外周血CECs 水平和活性能反映腫瘤的進展，常作為血管形成的標志物［21］。有研究顯示在大劑量的化療時，外周血CECs 出現短暫的下降，然而在化療間期又迅速反彈。一些節拍化療方案能使外周血CECs 和內皮前體細胞持續處于較低的水平，有可能產生持續抗腫瘤新生血管形成的作用［24］。我們的研究發現，在維持治療第6 周時，CPA 節拍化療組的CECs 和存活CECs 水平較生理鹽水對照組明顯降低，而聯合使用Endostar 時則產生了更強的下調作用。不同維持治療組間其外周血CECs 和存活CECs 的水平又與腫瘤體積和MVD 相關，可見，CECs 有作為CPA 節拍化療聯合Endostar 療效預測指標的潛在價值。

綜上所述，CPA 節拍化療聯合血管內皮抑制素Endostar 用于NSCLC 維持治療能延緩移植瘤生長，改善荷瘤鼠生存期，這可能與聯合用藥具有抗血管形成的增效作用有關。本研究為晚期NSCLC 維持治療提供了新的治療思路。

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