Bmi-1 促人膠質瘤SNB19 細胞生長惡化的作用機制*

蔣麗麗， 楊昌山， 趙燦國

(廣州醫學院病理生理學教研室，廣東 廣州510182)

膠質瘤是中樞神經系統腫瘤中最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內腫瘤的40%～50%。膠質瘤預后很差，其1 年累計生存率僅有30%，而多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的平均生存時間不到一年［1］;由于惡性膠質瘤具有侵襲性生長的特性，瘤灶往往與周圍腦組織邊界不清，盡管現代顯微外科技術、放療、化療等綜合治療措施已獲得巨大的進展，但是目前臨床上也難以做到病理學上的全切除，膠質瘤術后復發率非常高，這也是導致膠質瘤高死亡率的主要因素［2］。此外，腫瘤細胞的迅速繁殖和腫瘤內部血管大量增生，也是導致腫瘤進展快、病人迅速致死，以及術后復發的重要因素［3］。所以，針對膠質瘤高速增殖、高度侵襲性、血管大量增生的研究成為目前膠質瘤研究的熱點，找到抑制膠質瘤增殖、侵襲和血管增生的方法可能成為治療膠質瘤、預防膠質瘤復發的有效途徑。

Bmi-1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog)是多梳家族(polycomb group，PcG)成員之一，能與該家族其它成員形成蛋白復合體，作用于染色質上的多梳基因反應元件(polycomb response elements，PREs)，通過調控組蛋白的乙酰化或去乙酰化修飾過程，影響細胞增殖、凋亡過程［4-6］。已有研究在人膠質瘤中證實，Bmi-1 的表達水平與膠質瘤的病理分級和預后密切相關。Bmi-1 能夠通過激活核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)細胞信號通路，啟動下游相關基因表達，從而增強細胞抗凋亡和侵襲的能力，進一步促進膠質瘤的發生發展［7-8］。而NF-κB 作為一種廣泛存在于真核細胞內的轉錄因子，通過其轉錄調控活性，誘導一系列下游靶基因的表達，參與促進細胞增殖，促進細胞運動及血管生長等多種生物學過程［9］。大量研究證實NF-κB 信號途徑在膠質瘤中被廣泛激活并參與促進膠質瘤發生發展過程［10］。

本研究在膠質瘤SNB19 細胞中提高或降低Bmi-1 的表達，通過一系列生物學實驗，探討Bmi-1對SNB19 細胞的增殖、侵襲運動和血管生成能力的影響，以期尋找膠質瘤發生發展過程中的重要影響因素，從而為臨床控制和治療膠質瘤，提高患者生存率提供理論研究基礎。

材 料 和 方 法

1 細胞系及其培養

人膠質瘤SNB19 細胞用含有10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM 培養基培養，孵育37 ℃，飽和濕度和5%CO2條件下培養，每2 ～3 d 傳代1 次，取對數生長期細胞進行實驗。NF-κB 抑制劑JSH-23 購自EMD。

2 免疫印跡法

蛋白裂解液裂解細胞，并用超聲破碎儀破碎細胞DNA。96 孔板BCA 法進行蛋白濃度測定。SDS變性蛋白質電泳法檢測蛋白表達水平。9%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;三明治法正確放置凝膠和PVDF，70 V 電壓轉移3 ～4 h;取出PVDF 膜，將PVDF 膜浸入封閉液中，37℃平緩搖動1 h;將PVDF膜浸入含5 mL Ⅰ抗的雜交袋中，排盡氣泡，封口，4℃平緩搖動過夜;TBS/T 漂洗干凈后，將PVDF 膜浸入含5 mL Ⅱ抗的雜交袋中，排盡氣泡，封口，37℃平緩搖動1 h;再經TBS/T 充分漂洗，ECL 化學發光及膠片曝光對比結果。

3 實時熒光定量PCR

Trizol 法提取細胞總RNA;RNA 反轉錄為cDNA;PCR 反應體系:上游引物1 μL;下游引物1 μL;工作液Master Mix 10 μL;滅菌水4 μL;cDNA3 μL;PCR 反應條件:50 ℃2 min;5 ℃10 min;95 ℃15 s;60 ℃1 min;60 個循環。

引物序列:cyclin D1 上游引物5'-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3'，下游引物5'-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3';Myc 上游引物5'-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3'，下游引物5'-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3';Twist 上游引物 5'-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3'，下 游 引 物 5'-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3';MMP-9 上游引物5'-ACGACGTCTTCCAGTACCGA-3'，下游引物5'-TTGGTCCACCTGGTTCAACT-3'，上 游 引 物 5'-GTGTCCAGTGTAGATGAACTC-3';VEGF-C 下游引物5'-ATCTGTAGACGGACACACATG-3'，GAPDH 上游引物5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3'，下游引物5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3'。

4 MTT 比色法

收集對數期細胞，調整細胞濃度至3 ×107/L，分種于96 孔板，每孔100 μL，即3 000 cells/well;每24 h 向待測孔中加入5 g/L MTT 溶液20 μL;再將96 孔板置37 ℃、5%CO2培養箱繼續培養4 h;小心吸去培養基，加入100 μL DMSO 置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解;在酶聯免疫檢測儀570 nm測量各孔的吸光度值。

5 Transwell 小室體外侵襲實驗

24 孔板內放置Transwell 小室，Matrigel 混合液均勻鋪于小室上層底部;準備好的細胞懸液(1 ×104細胞)(不含血清)，加至小室上層;小室下層加入含10%FBS 的DMEM 培養基，37 ℃孵箱培養;22 ～24 h后，取出小室，用大槍頭吸除小室底部Matrigel，以1×PBS 洗2 次;用甲醇/冰醋酸(V/V=3/1)混合液固定小室膜上的細胞，室溫，10 ～15 min;1 ×PBS 洗1次，蘇木素復染10 ～15 min，自來水漂洗，洗去多余藍色;顯微鏡下觀察，隨機選取10 個視野進行統計計數。

6 血管內皮細胞成管實驗

人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)細胞無血清培養24 h;取200 μL matrigel 鋪于24 孔板;HUVECs 細胞以條件培養基重懸至2 ×104/300 μL，鋪于24 孔板孔中Matrigel上;37 ℃細胞孵育箱中孵育20 h;倒置顯微鏡下觀察拍照，比較各處理組細胞成管數的差異。

7 質粒、轉染及雙熒光報告基因系統

pMSCV/Bmi-1 及pSuper-retro-Bmi-1-RNAi 由中山大學附屬腫瘤醫院宋立兵教授贈予［11］。質粒pNF-κB-luc 購自Clontech，pRL-TK renilla 購自Promega。質粒轉染試劑脂質體2000 購自Invitrogene。pNF-κB-luc 質粒(或對照質粒)100 ng 混合pRL-TK renilla 質粒10 ng，與含脂質體2000 2 μL(24 孔板每孔)的混合液充分混合后加至細胞培養液中，轉染后6 h 更換新鮮培養基。繼續培養至24 h 后檢測各處理組細胞的NF-κB 轉錄活性。

用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual-luciferaseTMReport Assay Kit，購自Promega)檢測螢光素酶活性，按說明書操作。吸去培養基，1 ×PBS 洗細胞1 次;每孔加入100 μL 1 ×passive lysis buffer，置搖床上劇烈振蕩15 min;振蕩后將每孔中的液體移入1.5 mL 離心管中，10 000 r/min 離心1 min;取20 μL上清液加入96 孔板中，置多功能酶標儀中按照Gen5軟件步驟操作先加入LARⅡ100 μL 檢測螢火蟲螢光素酶活性，加入Stop ＆ Glo 100 μL 停止反應后再檢測海腎螢光素酶活性。所有螢火蟲螢光素酶活性均以海腎螢光素酶活性正態化后得到相對值，實驗數據取3 個重復孔平均值，分析比較各處理組結果。

8 細胞免疫熒光染色

玻片滅菌處理后鋪于24 孔板內，將適量細胞接種于玻片上培養22 ～24 h;2%多聚甲醛(針對核蛋白)固定細胞10 min;加0.2%Triton(用PBST 稀釋)室溫放置5 min;加10%BSA 于水平搖床上，封閉10 min;孵Ⅰ抗(anti-NF-κB，1/100 稀釋)，室溫孵育1 h;孵Ⅱ抗(1/500)，室溫避光孵育30 ～45 min;DAPI(1∶10 000，稀釋)，室溫避光孵育10 min，;PBS 洗1～2 次后，過夜晾片，次日用anti-fade 封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。

9 統計學處理

實驗重復3 次，數據用均數± 標準差(mean ±SD)表示。應用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，組間比較應用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 在膠質瘤細胞中高表達Bmi-1 或抑制Bmi-1 的表達

構建 pMSCV-Bmi-1 以 及 pSuper-retro-Bmi-1-RNAi 質粒，磷酸鈣法制備逆轉錄病毒，感染膠質瘤細胞SNB19;24 ～28 h 后，加入嘌呤霉素(0.5 mg/L)篩選陽性克隆，成功建立高表達和沉默Bmi-1 表達的穩定細胞株。收集細胞株的RNA 和蛋白，通過免疫印跡法檢測Bmi-1 在這些細胞中的表達水平，鑒定穩定表達Bmi-1 的細胞株。結果顯示，感染pMSCV-Bmi-1 病毒的細胞，Bmi-1 表達水平均比對照組有顯著增加，而感染pSuper-retro-BMI-RNAi 病毒的細胞，Bmi-1 的表達被顯著下調，見圖1。

Figure 1. The protein expression of Bmi-1 in glioma cells measured by Western blotting. The glioma SNB19 cells were infected with Bmi-1 or Bmi-1-RNAi virus for 48 h and selected with puromysin (0.5 mg/L)for 4 days.Mean±SD. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs vector;##P ＜0.01 vs vector-RNAi.圖1 免疫印跡法檢測Bmi-1 蛋白表達

2 Bmi-1 體外促進膠質瘤細胞增殖能力

MTT 實驗結果顯示，相比陰性對照組，高表達Bmi-1 的細胞具有更強的增殖生長能力，而抑制Bmi-1 表達的細胞生長增殖能力則明顯變弱，見圖2。結果說明，高表達Bmi-1 能夠促進膠質瘤細胞的增殖，促進腫瘤的生長。

Figure 2. The proliferation of glioma cells measured by MTT assay. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs vector;#P ＜0.05 vs vector-RNAi.圖2 MTT 法檢測Bmi-1 對細胞增殖能力的影響

3 Bmi-1 增強膠質瘤細胞體外侵襲運動能力

體外小室侵襲實驗結果顯示，與對照組細胞相比，高表達Bmi-1 的細胞更多更快地穿過小室底的Matrigel 層和底膜到達小室底的另一面，而抑制Bmi-1 表達的細胞則表現出在相同的時間內，能穿越小室Matrigel 和底膜的細胞數明顯減少，見圖3。說明Bmi-1 能夠增強膠質瘤細胞在體外的侵襲運動能力。

Figure 3. The invasion of glioma cells measured by Transwell matrix penetration assay (hematoxylin staining，×200).Mmean±SD. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs vector;##P ＜0.01 vs vector-RNAi.圖3 Bmi-1 對膠質瘤細胞侵襲能力的影響

4 Bmi-1 體外促進膠質瘤血管增長的能力

利用HUVECs 體外培養成管的特性，將其置于不同處理組細胞的培養上清液(無血清)中培養，結果發現，與對照組相比較，高表達Bmi-1 的細胞組，其上清液可使內皮細胞更快地形成封閉的小管;相反，抑制Bmi-1 表達的細胞組，其上清液的表現則相反，內皮細胞較少連接成管，見圖4。這組結果提示Bmi-1 具有體外促進血管形成的作用。

5 Bmi-1 通過激活NF-κB 信號通路，促進膠質瘤細胞生長、運動及血管增生

應用雙螢光素酶報告系統檢測NF-κB 活性，結果發現，相對于對照組細胞，高表達Bmi-1 的細胞NF-κB 報告基因的螢光素酶活性明顯增強，而沉默Bmi-1 表達的細胞組NF-κB 報告基因的螢光素酶活性則明顯降低，見圖5。這說明Bmi-1 能夠激活NFκB 的轉錄活性。

Figure 4. Tube formation of HUVECs cultured on Matrigel-coated plates with condition medium from indicated cells(×100).Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs vector;##P ＜0.01 vs vector-RNAi.圖4 HUVECs 體外成管實驗檢測不同處理組細胞上清對血管生成的作用

Figure 5. Transcriptional activity of NF-κB detected by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs vector;##P ＜0.01 vs vector-RNAi.圖5 雙螢光素酶報告基因系統檢測NF-κB 的轉錄活性

通過細胞免疫熒光染色檢測NF-κB 在細胞內的定位發現，高表達Bmi-1 的細胞，細胞核內有明顯的NF-κB 聚集，而抑制Bmi-1 表達的細胞，NF-κB 集中在細胞漿內表達，見圖6。結果提示，Bmi-1 具有促進NF-κB 發生核轉位的作用，進一步說明Bmi-1 能夠激活NF-κB 的轉錄活性。

Figure 6. NF-κB location detected by cytoimmunofluorescence staining (×1 000).圖6 細胞免疫熒光染色檢測NF-κB 細胞內定位

通過實時熒光定量PCR 檢測一系列NF-κB 下游靶基因的表達，結果發現，高表達Bmi-1 的細胞其NF-κB 下游靶基因的表達也普遍被上調，而抑制Bmi-1 表達細胞組這些基因的表達也被抑制。其中cyclin D1、Myc、Twist、MMP-9 和VEGF-C 已被證實與腫瘤細胞的增殖、運動、血管增殖密切相關，見圖7。

使用NF-κB 的特異性抑制劑JSH-23 抑制NF-κB的轉錄活性后發現，盡管高表達Bmi-1，一旦NF-κB 活性被抑制，細胞的增殖、侵襲運動和血管增生能力也被抑制，見圖8 ～10。這些結果都說明Bmi-1 是通過激活NF-κB 信號通路，進而轉錄激活NF-κB 下游的與細胞增殖、運動侵襲、血管增生相關的一系列基因表達，從而增強膠質瘤細胞的惡性能力。

討 論

本文通過一系列細胞和分子生物學實驗證實，Bmi-1 在膠質瘤的發生發展過程中起到重要的促進作用。高表達Bmi-1 的膠質瘤細胞呈現出更強增殖、侵襲運動和血管增生能力，而抑制Bmi-1 表達的細胞這些能力也被抑制。本文還證實Bmi-1 體外促進膠質瘤細胞這些能力的作用是通過激活NF-κB 信號通路，進而增強其下游基因的表達實現的。

已有研究證實，Bmi-1 的表達與膠質瘤臨床病理分級和患者生存時間具有密切相關性。且Bmi-1 的表達能夠明顯抑制阿霉素處理或者紫外線照射所誘導的膠質瘤細胞的凋亡;且Bmi-1 的這種生物學功能可能是通過誘導IκB 的磷酸化激活NF-κB 的轉錄活性，并由此增強神經膠質瘤細胞抗凋亡能力［7］。

Figure 7. The mRNA expression of the downstream genes of NFκB detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Mean ± SD. n = 3. * P ＜0. 05 vs vector;#P ＜0.05 vs vector-RNAi.圖7 實時定量PCR 檢測NF-κB 下游靶基因mRNA 表達水平

此外，Bmi-1 作為多梳家族蛋白的一員，已被證實在多種腫瘤中高表達，包括急性粒細胞性白血病、肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌和結腸癌。Bmi-1是一個癌蛋白，在這些腫瘤中起到重要的作用，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、抗凋亡和血管增生過程［5-6，8，12］。因此，鑒于Bmi-1 在腫瘤發生發展過程中所起到的促進作用，使得Bmi-1 在腫瘤的治療上受到關注。Bmi-1 作為一個潛在抗腫瘤靶標，具有更高更有應用價值的研究意義。

Figure 9. Invasion of Bmi-1-expressing cells treated with DMSO or JSH-23 measured by Transwell assay.Mean±SD. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs Bmi-1 +DMSO.圖9 抑制NF-κB 作用對高表達Bmi-1 的細胞侵襲能力的影響

Figure 10. Quantification of tube formation of HUVECs cultured on Matrigel-coated plates with condition medium from Bmi-1-expressing cells treated with DMSO or JSH-23.Mean±SD. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs Bmi-1 + DMSO.圖10 抑制NF-κB 作用對高表達Bmi-1 的細胞血管增殖能力的影響

NF-κB 信號通路在機體免疫等生理過程，感染、炎癥、腫瘤等病理過程中發揮重要作用，被廣泛研究［9］。迄今已發現，NF-κB 信號通路的激活既是機體抵抗病原侵入基礎，又是病原造成機體損害的機制;既支持細胞正常生存、增殖和分化過程，又在細胞惡性轉化、腫瘤發生、發展中起著關鍵作用。研究表明，NF-κB 信號調控可能將感染、炎癥與腫瘤發生相互聯系。由此可見，NF-κB 作為信號轉導通路調控樞紐發揮著重要作用，闡明其調控機制，對于深入了解感染、炎癥和腫瘤發生的病理過程，以及這些重要病理事件之間的相互關系，并在此基礎上發展更有效、更優化的抗感染、抗炎癥，尤其是抗腫瘤新策略，具有重大意義。

研究已證實，NF-κB 可能在抑制腫瘤細胞凋亡的過程中具有重要作用，抑制NF-κB 的活化可以增強一系列凋亡誘導劑，如炎癥因子、電離輻射和化療藥物等的致凋亡作用效應。NF-κB 的異常活化參與到腫瘤發生、侵襲和轉移等不同生物學過程中，通過激活相關基因的轉錄，促進腫瘤惡性進展［13］。目前已證明在結腸癌、乳腺癌、非小細胞性肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、T 或B 淋巴細胞白血病、膀胱癌及幾種病毒誘導的腫瘤中，均存在NF-κB 異常高表達和激活。腫瘤細胞NF-κB 信號轉導通路的異常活化與多種作用機制有關。在細胞漿，Akt 通過調節IKK/IκB 使得NF-κB 發生核轉位而被活化。在細胞核內，多種核蛋白諸如CDK5 激活物結合蛋白LZAP、p53 和ARF 能調節NF-κB 激活的特異性［14］。此外，NF-κB 的轉錄活性能夠通過Akt 或腫瘤抑制基因ARF 的激活而發生改變，而Akt 和ARF 都是Bmi-1調控的下游基因［15］。以上發現提示我們Bmi-1 可能參與了調控NF-κB 信號轉導通路從而增強了膠質瘤細胞生長增殖、侵襲運動及血管增生能力。

Cyclin D1、Myc、Twist、MMP-9 和VEGF-C 已被證實與腫瘤細胞的增殖、運動、血管增殖密切相關［3］。我們的研究證實Bmi-1 對NF-κB 信號通路的激活作用能增強cyclin D1、Myc、Twist、MMP-9 和VEGF-C 的表達，從而實現了其促膠質瘤細胞增殖、侵襲運動和血管增生的作用。綜上所述，本文的研究不僅豐富了膠質瘤侵襲運動過程的理論機制研究，更為其治療提供了新的方向和靶標，具有重要的生物學和醫學研究意義。

通過本文的研究，我們認為Bmi-1 在膠質瘤的進展過程中，起著促癌作用，能夠促進膠質瘤細胞的惡性進展，增強其細胞增殖、侵襲和血管增生能力。我們通過抑制Bmi-1 的表達在體外能夠抑制膠質瘤細胞的各種惡性表型，證實Bmi-1 可能作為潛在的治療靶標，在膠質瘤的診斷治療過程中，具有重要的研究價值和前景。

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