抗凍蛋白及其抗凍機(jī)理研究進(jìn)展

姚 佳 ，劉顯慶 ，單旭東 ，熊華彰 ，彭大才 ，張 明

（1.四川省雅安市農(nóng)業(yè)局畜牧發(fā)展中心，四川 雅安 625000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 雅安 625014）

抗凍蛋白（AFP）最早是在昆蟲當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的，1964年Ramsay在黃粉甲幼蟲中發(fā)現(xiàn)一種冰點(diǎn)低于熔點(diǎn)的物質(zhì)，1968年Grimstone通過實(shí)驗(yàn)證明這種物質(zhì)是蛋白質(zhì)。魚類抗凍蛋白是1969年Devries在南極Mcmurdo海峽一種叫做 Nototheneniid（Trematomas Borchgrevinki）的極地魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，這類抗凍蛋白也成為迄今為止被廣泛研究的一類抗凍蛋白。

1 抗凍蛋白的分類

抗凍蛋白存在于不同的生物體內(nèi)，據(jù)此可以將抗凍蛋白分為四類：魚類抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白和細(xì)菌抗凍蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的魚類抗凍蛋白有5種，這5種抗凍蛋白不僅在結(jié)構(gòu)、功能上存在差異，而且與冰晶作用的方式也不盡相同。植物抗凍蛋白的研究起步較晚，已經(jīng)從幾十種植物當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白，但分離純化的很少。昆蟲抗凍蛋白分離純化出了幾種，它們的抗凍活性比魚類抗凍蛋白的活性更高，但純化后的活性有所降低。關(guān)于細(xì)菌抗凍蛋白的研究相對較少。表1中所示的是幾種不同抗凍蛋白的分子量、蛋白結(jié)構(gòu)等基本特征。

2 抗凍蛋白的特性

2.1 多樣性 現(xiàn)在已經(jīng)在魚類、昆蟲、植物甚至細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白，這些不同生物間的抗凍蛋白從序列和結(jié)構(gòu)上存在根本的差異，甚至相同科不同種屬間的抗凍蛋白也存在差異（見表1）。Jia和Feeney認(rèn)為抗凍蛋白的這種多樣性可能與其進(jìn)化有關(guān)，不同的AFP由不同的蛋白質(zhì)祖先進(jìn)化而來。

表1 不同種類抗凍蛋白的基本特征

2.2 熱滯活性 AFP能特異地吸附于冰晶表面，阻止冰晶生長，非依數(shù)性地降低溶液冰點(diǎn)，但不影響溶液的熔點(diǎn)，導(dǎo)致熔點(diǎn)與冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差異。冰點(diǎn)和熔點(diǎn)的差值稱為熱滯值，這一現(xiàn)象稱為AFP的熱滯活性（THA），這是AFP的一個(gè)重要特性。由于所有抗凍蛋白都具備熱滯活性，因此抗凍蛋白也被稱為熱滯蛋白（THP），但不同抗凍蛋白的熱滯值均有所不同。影響熱滯活性的因素主要有AFP濃度、肽鏈長度和一些小分子量溶質(zhì)。AFP濃度越大，熱滯活性越強(qiáng)；高分子的肽比低分子的肽熱滯活性更強(qiáng)；一些小分子量的溶質(zhì)如檸檬酸鈉、甘油和山梨醇能顯著阻止冰核形成，可提高熱滯活性。

2.3 重結(jié)晶抑制作用 重結(jié)晶是指在已形成的晶體顆粒之間進(jìn)行生長重分配，有的增大，有的減??；大的愈大，小的愈小。在低溫和超低溫冷凍過程中，重結(jié)晶多發(fā)生在溫度波動時(shí)，形成的大冰晶對細(xì)胞的損害是致命的。AFP抑制重結(jié)晶的特性是它與冰作用的結(jié)果。一般AFP抑制重結(jié)晶的作用在極低濃度下（＜0.1μg/mL）就可以發(fā)揮作用，形成的晶粒體積小且均勻，對細(xì)胞和組織的損害也較小。

2.4 改變冰的生長習(xí)慣 AFP降低溶液冰點(diǎn)、產(chǎn)生熱滯活性、抑制重結(jié)晶的特性是它與冰作用的結(jié)果。除此之外，AFP還能改變冰的生長習(xí)慣。通常情況下，冰是沿平行于基面的方向（a軸）生長，很少有沿晶格表面方向（c軸）生長的。而在加入AFP的溶液中，冰的這種生長習(xí)慣發(fā)生了改變，冰核逐漸沿c軸方向以針形、纖維狀生長，最終形成對稱的雙六面體金字塔形冰晶，而不是能對細(xì)胞和組織產(chǎn)生較大傷害的樹枝狀冰晶。見圖1。由于抗凍蛋白具有以上影響冰的形狀及生長的特性，因此也被稱為“冰結(jié)構(gòu)蛋白”。

圖1 冰晶生長方向示意圖

2.5 抗凍蛋白與細(xì)胞膜的作用 Rubinsky發(fā)現(xiàn)魚類抗凍蛋白具有在低溫下保護(hù)細(xì)胞膜的功能。但其作用機(jī)制尚不十分清楚。當(dāng)然某些情況下抗凍蛋白也是一種膜毒害劑，如Hincha等研究發(fā)現(xiàn)，AFGP和AFPs在植物冷凍過程中實(shí)際破壞了類囊體，通常認(rèn)為可能是AFP進(jìn)入脂雙層，破壞其結(jié)構(gòu)引起滲漏的原因；Melanie等認(rèn)為產(chǎn)生這種毒害作用的原因可能是轉(zhuǎn)移到植物中的AFP基因的表達(dá)發(fā)揮了細(xì)胞膜低溫保護(hù)作用，從而降低了細(xì)胞對冷的敏感性。

3 抗凍蛋白的作用機(jī)制

3.1 吸附抑制學(xué)說 吸附抑制學(xué)說最早由Raymond和Devries在1977年提出，他們認(rèn)為抗凍蛋白吸附在冰晶表面通過Kelin效應(yīng)抑制其生長。吸附抑制學(xué)說還認(rèn)為抗凍蛋白濃度越高則抗凍效果越好，但有時(shí)低濃度的抗凍蛋白反而能起到更好的效果；吸附抑制學(xué)說還認(rèn)為抗凍蛋白的抑制重結(jié)晶作用對保護(hù)大體積細(xì)胞（如卵細(xì)胞）有利，但其實(shí)抗凍蛋白對小體積細(xì)胞也能起到保護(hù)作用；另外，吸附抑制學(xué)說忽略了抗凍蛋白與細(xì)胞膜的相互作用、抗凍蛋白之間以及抗凍蛋白和冰晶復(fù)合體之間的團(tuán)聚作用等因素。

3.2 “偶極子-偶極子”假說 該假說由Yang等在1988年提出，他認(rèn)為AFPs具有顯著平行于其螺旋軸親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的偶極子。

3.3 氫原子結(jié)合模型 氫原子結(jié)合模型認(rèn)為AFP結(jié)構(gòu)中的氫原子與冰晶上的氧原子匹配并結(jié)合，具有很高的冰結(jié)合專一性，而其自身的氨基酸組成和螺旋結(jié)構(gòu)有利于提高結(jié)合的穩(wěn)定性。這個(gè)理論適合于AFGP和AFPⅢ等。如AFGP的左手螺旋結(jié)構(gòu)將具有雙親特性的雙糖暴露于溶液當(dāng)中，其中親水的一面與生長的冰面結(jié)合，而疏水的一面則抑制冰晶的生長。

3.4 剛體能量學(xué)說 剛體能量學(xué)說是把AFP視為小粒子，根據(jù)表面能最小原理以及“AFP-冰”與“AFP-水”界面之間的表面能差異，AFP能強(qiáng)烈吸附在冰晶表面。當(dāng)然除此之外，AFP必須與冰晶相匹配，否則水分子就會擴(kuò)散至界面，隨著冰晶的生長使蛋白向前推進(jìn)。反之，只有當(dāng)水分子足夠多到吞沒AFP后，才能形成新的冰晶。

3.5 冰核抑制學(xué)說 冰核是形成冰晶的基礎(chǔ)，沒有冰核的存在，冰晶就不可能生長。冰核抑制學(xué)說是近年來對抗凍蛋白作用機(jī)制的一種新的見解和補(bǔ)充。2003年，Ning Du等通過實(shí)驗(yàn)具體闡述了這種作用機(jī)制，第一次發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白可以通過吸附在灰塵和冰核的表面，減少它們之間的聯(lián)合來抑制新的冰核形成。

4 應(yīng)有與展望

4.1 應(yīng)用

4.1.1 在食品工業(yè)上的應(yīng)用。在冷凍肉類、蔬菜以及冰淇淋制作上，抗凍蛋白抑制冰晶生長的特性可以減少食品營養(yǎng)損失，保持食物口感好，維持食品原有狀態(tài)等。

4.1.2 在農(nóng)作物抗寒上的應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把異源抗凍蛋白的基因轉(zhuǎn)移到不耐寒作物上，可以增強(qiáng)作物的耐寒能力，還可以改善作物在收獲后的儲藏加工特性。

4.1.3 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。在器官組織的低溫保存中應(yīng)用抗凍蛋白，能夠盡量減少低溫對器官組織的破壞；抗凍蛋白應(yīng)用于冷凍手術(shù)，可以保護(hù)需要的組織不受破壞。

4.1.4 在卵母細(xì)胞、胚胎、精液冷凍中的作用。Rubinsky首先發(fā)現(xiàn)AFP具有在低溫下保護(hù)哺乳動物卵母細(xì)胞的作用，他將牛卵母細(xì)胞分別用AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵膜的完好程度、體外成熟率、可受精能力均較未用抗凍蛋白處理的對照組有明顯提高。另外，抗凍蛋白還成功應(yīng)用于牛羊胚胎的冷凍?？箖龅鞍自趯β涯讣?xì)胞、胚胎、精液進(jìn)行冷凍保存時(shí)主要是通過添加到其他抗凍保護(hù)劑中來發(fā)揮作用的，最終改善冷凍質(zhì)量和解凍后的活力、受胎率等。

4.2 展望 Solomon等將AFPⅠ基因?qū)氪竽c桿菌中，得到了高水平表達(dá)，說明可以用基因工程的方法規(guī)?；a(chǎn)AFP。直接將抗凍蛋白的基因整合到動植物基因組中使之穩(wěn)定表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生有活性的產(chǎn)物，同樣有很多成功的例子。但是對胚胎、精液等的冷凍保存仍存在一些問題，需要進(jìn)一步從原理上解決。如果抗凍蛋白與細(xì)胞膜的作用一旦了解清楚，可能會成為解決胚胎、精液等冷凍保存的一個(gè)突破。對昆蟲、細(xì)菌的抗凍蛋白研究起步較晚，尤其是昆蟲的抗凍蛋白具有比魚類更為有效的抗凍效果，但對它們的研究還需深入。此外，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)耐寒的動植物新品種（系）也是一個(gè)值得挑戰(zhàn)的方向。

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