特定序列寡核苷酸對人骨髓間充質干細胞體外擴增及成骨分化的影響

劉春秀 滿大鵬 杜曉巖 康寧 董平 肖苒 王麗穎

人骨髓間充質干細胞 （Human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）是組織工程重要的種子細胞，來源廣泛，取材方便，但在骨髓中的含量很少。目前，應用生長因子促進BMSCs體外擴增及成骨分化的研究取得了一定成果，同時也暴露出一些問題，如生長因子不易人工合成、價格昂貴，需要通過構建不同的載體才能進入細胞內發揮作用等。ODN是指含有50個以下核苷酸單體的多核苷酸鏈，具有高效低毒、性質穩定、易于合成等優點。研究發現，人工合成的ODN能夠顯著促進大鼠BMSCs的增殖及成骨分化，并且能夠促進大鼠成骨細胞、人成骨樣細胞、人牙周膜干細胞及脂肪干細胞的增殖[1-4]，本實驗選取一種前期研究中作用明顯的ODN進行研究，觀察其對人骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化的影響，為ODN用于骨組織工程種子細胞擴增與成骨分化的可行性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及材料

倒置熒光顯微鏡（Nikon公司），流式細胞儀（BD公司），多標記微孔板檢測系統（PerkinElmer公司）。

人骨髓間充質干細胞（北京協和醫院整形外科醫院研究中心惠贈），寡核苷酸（吉林大學基礎醫學院王麗穎教授惠贈，大連寶生物公司合成），Ficoll淋巴細胞分離液（GE Healthcare公司），干細胞培養基（Sciencell公司），DMEM 低糖培養基、DMEM 高糖培養基、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司），特級胎牛血清（GIBCO公司），CCK-8（Dojindo研究所，日本），堿性磷酸酶試劑盒（南京建成研究所）。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs體外分離、培養及鑒定

自患者髂前上棘抽取5 mL骨髓血（獲知情同意，患者各項指標均正常），Ficoll梯度密度離心法收取單核細胞層，用10 mL干細胞培養基吹打混勻，接種至75 cm2的培養皿中，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱孵育，待細胞匯合至80%～90%時，1∶3傳代，觀察細胞形態；傳代后，取第2代生長良好的hBMSCs，消化離心，用含1%BSA的PBS洗滌3次后計數， 分別加入 CD73、CD90、CD105、CD34 單克隆抗體，同時每管樣品設立同型陰性對照，避光冰上孵育45min，用含1%BSA的PBS洗滌細胞3次，以除去未結合抗體，用200μL含1%BSA的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測分析；第3代hBMSCs匯合至80%～90%后，消化離心，以5000/cm2的密度接種至6孔板中，待細胞匯合至60%～70%后分別更換成骨（LG-DMEM，10%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 mM β-甘油磷酸鈉，10-8M地塞米松，0.05 mM維生素C）及成脂誘導液（HG-DMEM，10%胎牛血清，1%青鏈霉素，10-7M地塞米松，10 μM胰島素，0.5 mM吲哚美辛，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤），72 h換液一次；取細胞懸液滴至6孔板中的細胞爬片上，貼壁后加入完全培養基，第2天更換成軟骨誘導液（LG-DMEM，1%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 μg/L TGF-β1，0.1 M L-脯氨酸，1× ITS），72 h 換液一次。

1.2.2 ODN MT01對hBMSCs體外擴增的影響

第3代hBMSCs匯合至80%～90%時，消化離心，干細胞培養基重懸，并計數，將細胞濃度調整為2000個/孔，接種至96孔板中，對照組和實驗組均設5個復孔，周圍孔加PBS以防止邊緣效應產生。24h細胞全部貼壁后，實驗組加入1 μg/mL ODN MT01（5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3'），對照孔加入等量PBS。48 h換液一次，24h取一板，將10μL CCK-8加入各孔中，37℃避光孵育4h，多標記微孔板檢測系統檢測。

1.2.3 ODN MT01對hBMSCs成骨分化的影響

當第3代hBMSCs匯合至80%～90%時，消化離心，用完全培養基重懸，并細胞計數，調整細胞濃度為8000個/孔接種至六孔板，對照組和實驗組均設3個復孔，待細胞完全貼壁后換成骨誘導液，實驗組加入 1 μg/mL ODN MT01，對照孔加入等量 PBS，72 h換液一次，于第4、7、14、21天 用ALP試劑盒檢測。

1.3 統計學處理

SPSS 17.0統計學分析軟件進行處理，均采用多樣本單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義，P>0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長與形態學特征

倒置顯微鏡下觀察，原代細胞培養24h可見圓形透明的細胞貼壁，4 d后見細胞呈集落樣生長，細胞逐漸伸展開，呈單核的小多角形或短梭形，8～10 d后細胞可達80%匯合，且出現細胞聚集成群現象，傳代后細胞生長逐漸穩定，3～4 d可形成單層匯合，細胞分布呈束狀或漩渦狀（圖1）。流式細胞儀檢測CD73、CD90、CD105表達呈陽性，陽性率分別為94.4%、91.3%、87.8%；CD34表達陰性，陽性率為0.04%（圖2）。成骨誘導14 d后，茜素紅染色可見礦化結節；成脂誘導后14 d，油紅O染色可見脂滴；成軟骨誘導14 d，甲苯胺藍染色可見藍色異染顆粒，細胞外基質染成淺藍色的軟骨細胞（圖1）。

2.2 ODN MT01對hBMSCs體外擴增的影響

檢測hBMSCs接種后7 d的OD值，發現ODN MT01組在第3、4、5天的OD值與對照組相比有統計學差異（P<0.05），第6、7 d的OD值與對照組差異明顯（P>0.01）（圖 3）。

2.3 ODN MT01對hBMSCs成骨分化的影響

成骨誘導后第4、7、14、21 d的堿性磷酸酶吸光度值分析發現，成骨誘導第 4、14、21天，ODN MT01組ALP的OD值與對照組比較有統計學意義，第7天實驗組與對照組相比無明顯差別（圖4）。

圖1 hBMSCs形態學觀察及多向分化鑒定Fig.1 Morphology observation and multi-differentiation identification of hBMSCs

圖2 人骨髓間充質干細胞表面標志物的表達Fig.2 The expression of surface markers of human bone marrow mesenchymal stem cells

圖3 ODN MT01對hBMSCs增殖的影響（*：與對照組比較 P<0.05；**：與對照組比較 P<0.01）Fig.3 The influences of ODN MT01 on the proliferation of hBMSCs(*:vs control group P<0.05;**:vs control group P<0.01)

3 討論

BMSCs是骨組織工程重要的種子細胞，梯度密度篩選法分離BMSCs雖然操作繁瑣，但純度較高[5]。2006年，國際間充質干細胞委員會提出了MSCs的三條最低標準：塑料黏附性、特定的表面抗原表達和多向分化潛能[6]。本實驗利用Ficoll梯度密度離心法分離純化hBMSCs后，從形態學觀察、表面標志物檢測及多向誘導鑒定三方面證實了所分離純化出的細胞具備干細胞特征。

圖4 ODN MT01作用于hBMSCs第 4、7、14、21天 ALP表達OD值比較（*：與對照組相比P<0.05）Fig.4 Comparison of ALP activity of hBMSCs deal with ODN MT01 at 4,7,14,21 day(*:P<0.05,vs control group)

BMSCs增殖和成骨分化因子的研究，如成纖維細胞生長因子（bFGF）[7-8]、骨形成蛋白 2（BMP2）[9-10]、富血小板血漿（PRP）[11-12]等，都取得了一定的成果。但大多因子需要載體運載，價格昂貴。ODN存在于自然界某些低等生物基因組的DNA中，且哺乳動物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用[13-15]。根據ODN的免疫調節作用，可將其分為3型：免疫刺激性的CpG ODN、中和性CpG ODN和不含CG基序的抑制性ODN。CpG ODN目前被廣泛研究，在哮喘、變態反應性疾病、感染性疾病和腫瘤的治療中效果良好[16-18]；不含CG基序的抑制性ODN MT01能夠調控一些重要成骨相關因子，如TNF-α、IFN-γ、RANKL、OPG、Osterix等，改變成骨細胞和破骨細胞的平衡影響骨代謝過程[1，19]。本實驗將人工合成的ODN MT01直接加入到干細胞培養基中，能夠持續穩定促進hBMSCs的增殖，加入到成骨誘導液中能夠有效增強堿性磷酸酶活性，特別是在14 d后，常規成骨誘導液中的細胞ALP活性降低，而ODN組的ALP活性仍能維持在較高水平，成骨活性較強，可能是ODN促進了細胞的增殖,使細胞數量增加，也可能是ODN通過調控成骨相關因子促進成骨分化，或兩者共同作用的結果。

綜上所述，特定濃度的ODN MT01對hBMSC的體外擴增和成骨分化具有一定的促進作用，但是關于ODN MT01促進hBMSC的增殖和成骨分化的機制尚未明確，我們將進行更為深入的研究。

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