棘胸蛙嗜水氣單胞菌的生物被膜特性

馬有智

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310030)

嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophica，Ah)是有鞭毛無莢膜的革蘭氏陰性短桿菌，可引起蛙類的紅腿病等［1］。由于抗生素的濫用，導致嗜水氣單胞菌的耐藥性增強，多重耐藥性菌株不斷增加［2-4］，給水產動物嗜水氣單胞菌病的防治造成困難，同時嚴重影響水產品的質量安全。生物被膜(Biofilm，BF)是指附著在任何物體表面或兩相交界面的具有一定結構的微生物群體，其外包裹了一層由其自身分泌的胞外多糖類基質［5］。與游離菌相比，形成生物被膜的細菌具有很多不同的性能，其特征是對抗菌劑的抗性增強。試驗對分離自發病的棘胸蛙細菌生物被膜進行測定和形態觀察，為監控嗜水氣單胞菌的耐藥性和有效防治嗜水氣單胞菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌AH02，AH03，AH06和AH07，分離自發病的棘胸蛙。小白鼠，體重15～20 g，購自浙江大學實驗動物中心，試驗前飼養3 d，證實健康后應用。健康棘胸蛙來自杭州某棘胸蛙養殖場，規格為25～35 g，室內暫養7 d無異常后應用。

1.2 生物被膜檢測

體外生物被膜形成及測定方法參照文獻 ［6］的微孔板法并進行適當改進。具體步驟:將細菌過夜培養液與新鮮BHI培養液按1∶3體積混勻后，取200μL加入到96孔酶標板小孔中，28℃濕盒靜置培養24 h，棄去培養液，用0.85%的無菌生理鹽水250μL洗滌2次以去除游離細菌，干燥后往各孔加入200μL 0.1%結晶紫染色液，染色30 min后棄去染色液，0.85%的無菌生理鹽水250μL洗滌3次，加入33%的乙酸溶液200μL，30 min后完全溶解，用酶標儀測其D570值。各試驗孔均設8個平行孔，以不含菌液的培養液為空白對照。

1.3 生物被膜掃描電鏡觀察

將細菌過夜培養液按1∶20稀釋，轉接到24孔細胞培養板上，各孔中垂直放置大小合適的無菌蓋玻片，28℃培養24 h。培養結束后，取出蓋玻片，按照電鏡掃描的要求進行制片觀察。

1.4 動物試驗

小白鼠毒力試驗。取分離株18 h BHI培養物，分別腹腔注射6只小白鼠。每只小鼠注射劑量為0.2 mL，觀察發病和致死情況。

動物回歸試驗。分離株接種于BHI液體培養基，28℃恒溫培養18 h后，細菌濃度調整為2.27×107mL-1備用。健康棘胸蛙隨機分成2組，實驗組取10只，按每只0.2 mL劑量腹腔注射菌懸液;對照組10只腹腔注射相同劑量無菌肉湯。連續觀察記錄7 d，對發病棘胸蛙無菌操作取其肝、脾等進行病原菌的分離純化。1.5 藥物敏感性試驗

藥物敏感性采用紙片 (藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司)瓊脂擴散法進行。調節菌懸液細菌濃度為1.7×107mL-1，操作方法及結果判定參照文獻 ［7］。

2 結果與分析

2.1 菌株生物被膜D值

圖1表明，4株細菌在BHI培養基28℃培養24 h后，形成生物被膜的能力不同，AH07最高，AH02和AH03次之，AH06最低。差異分析顯示，AH07，AH03與AH06之間有極顯著差異 (p＜0.01)，AH02與AH06之間有顯著差異 (p＜0.05)。

圖1 嗜水氣單胞菌分離菌株培養24 h的生物被膜測定結果

2.2 菌株生物被膜電鏡掃描

從電鏡掃描結果 (圖2)看，4株菌形成的生物被膜的緊密程度不同，AH07細菌之間緊密度最高;AH06緊密度最低，細菌之間不能緊密相連，形成較大的裂隙;AH02和AH03細菌間緊密度較AH07要低一些。

圖2 嗜水氣單胞菌分離菌株形成的生物被膜的電鏡掃描結果 (×10 000)

2.3 菌株對小白鼠的致病性

4株細菌對小白鼠均表現出一定的致病性，其中接種AH02，AH03和AH07等3株細菌的小白鼠均在24 h內死亡，AH06菌株引起3只小白鼠死亡，死亡率為50%，對照組無異常，顯示4株嗜水氣單胞菌分離菌株都具有一定的致病力，AH06菌株致病力較弱。

試驗組棘胸蛙腹腔注射菌懸液后，在7 d內注射AH02和AH07菌株的全部死亡，注射AH03的死亡9只，注射AH06組死亡6只，發病棘胸蛙表現出與自然發病棘胸蛙相似的癥狀，對照組無異常表現。

4株細菌均對氧氟沙星敏感;AH02，AH03和AH06對四環素、氯霉素、慶大霉素等藥物敏感;AH07對氨芐青霉素、大觀霉素、阿米卡星、四環素、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素耐藥。

3 小結與討論

細菌生物被膜是細菌耐藥性形成的重要機制之一，也是許多慢性感染性疾病反復發作和難以控制的主要原因，生物被膜的形成與細菌的致病性也具有一定的相關性［8-9］。分離自發病的棘胸蛙嗜水氣單胞菌菌株之間毒力存在差異，AH02，AH03和AH07等3株細菌對小鼠和棘胸蛙均具有較強的毒力，而AH06菌株的毒力較弱，菌株之間的差異也表現在理化特性上，AH06菌株V-P試驗為陽性，在綿羊血平板上不產生溶血現象，而溶血素與細菌毒力相關［10］。藥敏試驗表明4株分離菌對抗生素的敏感性不同，其中3株菌對左氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素等均敏感，而AH07菌株對氨芐青霉素等多種抗生素耐藥，且AH07菌株形成生物被膜的能力也最強，說明生物被膜的形成與細菌的耐藥性有一定的關系，這一結果為臨床防治中抗生素的選擇提供依據。4株分離菌的毒力和生物被膜形成能力具有一定的差異，AH02，AH03和AH07等3株細菌對試驗動物的致病性較強，其生物被膜的形成能力也較強，電鏡掃描圖也顯示緊密度要高一些，而AH06菌株的致病性與生物被膜的形成量均較其他3株菌低，說明致病性與生物被膜的形成有一定的關系，至于兩者之間關系的機制還需要進一步的研究。

［1］ 陸承平.致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚病綜述［J］.水產學報，1992(16):282-288.

［2］ 洪經，潘連德.魚源嗜水氣單胞菌質粒的指紋圖譜及其與耐藥性的關系［J］.水產學報，2010，34(12):1908-1915.

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［10］ John M P，Stephen P K，Radomin S.Secreted enzylmes of Aeromonas ［J］.F Microbiology，1997.15:1-10.