佛司可林類化合物對離體豚鼠氣管條舒張作用的研究

汪亞勤，曹水娟，殷嘉珺，黃建明，翁鴻博

(復旦大學藥學院，上海 201203)

毛喉鞘蕊花Coleμs forskohlii(Willd)Briq.系唇形科 Labiatae鞘蕊花屬Coleμs Loμr.植物，產于印度和我國云南省等地，主要用于治療感冒、咳喘等疾病。上世紀70年代，印度學者 Bhat等［1－2］從印度產毛喉鞘蕊花中分離到具有明顯降壓和強心作用的半日花烷型二萜，并由此引起人們對它的關注。國外研究主要集中于印度產品種中的有效成分佛司可林(forskolin)，其具有強大的腺苷酸環化酶激活作用，在臨床上用于治療心血管疾病、青光眼、支氣管哮喘等［3－6］。國產品種中尚未分離得到佛司可林，但分離得到了與之結構類似的異佛司可林，據報道具有平喘解痙，抑制血小板凝聚等作用［7－8］，從國產品種中已經分離得到與印度產品種中相同的二萜和一些新的二萜類化合物，但相關的藥理活性研究較少［9－11］。

在前期工作中，我們采用大孔樹脂等提取純化技術，獲得了毛喉鞘蕊花提取物，并進行了化學成分研究［12］。本文主要研究從國產毛喉鞘蕊花提取物中分離得到的5種半日花烷型二萜類化合物即異佛司可林、佛司可林G、J、A、I以及國外產毛喉鞘蕊花中主要有效成分佛司可林對His、ACh誘導的豚鼠離體氣管平滑肌標本收縮的影響，比較其舒張氣管平滑肌的作用，為國產毛喉鞘蕊花的進一步研究與開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 豚鼠，♀♂不限，體質量250－350 g(上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供)。

1.1.2 試劑 磷酸組胺(上海晶天生物科技有限公司);氯化乙酰膽堿(上海晶天生物科技有限公司);氨茶堿(上海信誼金朱藥業有限公司);佛司可林(純度大于98%，華誠生物科技有限公司);異佛司可林、佛司可林G、佛司可林J、佛司可林A、佛司可林I從國產毛喉鞘蕊花中分離得到，經MS、1HNMR、13C-NMR確定結構，采用HPLC-ELSD法測得其純度大于98%。其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 Hu-1型肌肉張力換能器(淮北正華生物儀器設備有限公司);MD3000型生物信號采集處理系統(淮北正華生物儀器設備有限公司);超級恒溫槽(上海衡平儀器儀表廠);離體器官恒溫肌槽(定制)。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的配制 取異佛司可林、佛司可林、佛司可林G以PEG400溶解至所需濃度，備用。佛司可林A，佛司可林 I ，先以100 μl二氯甲烷溶解，佛司可林J先以100 μl丙酮溶解，再用PEG400配成所需濃度，置60℃水浴中2 h，使有機溶劑完全揮發，備用。

1.2.2 豚鼠離體氣管平滑肌實驗 取豚鼠，♀♂不拘，頭擊處死。切開頸部皮膚及肌肉，取出氣管置于通有95%O2+5%CO2混合氣的 K reb’s營養液(NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.28 g、Glucose 2 g、加蒸餾水至1 000 ml)中，去除氣管周圍結締組織后將氣管剪成寬約3～5 mm、長約30 mm的螺旋條。置于含30 ml Kreb’s營養液的離體器官恒溫肌槽(37℃)中，通95%O2+5%CO2混合氣，下端固定于離體器官恒溫肌槽底部，上端連接于張力換能器，調節負荷為2 g，用MD3000型生物信號采集處理系統記錄張力的變化，每30 min換液1次，穩定1 h［13］。

1.2.3 對His誘導的收縮反應的影響 加入3.3 mmol·L－1組胺溶液，使其終濃度為 3 3 μmol·L－1，待組胺引起氣管條最大收縮時，換液，洗氣管條5次，換液，待基線平穩后，再次加入His溶液，記錄標本張力值，待其達到收縮峰值后，采用累積劑量法加入樣品溶液或空白對照溶液，或一次性加入陽性對照液 4 4 mmol·L－1氨茶堿，其終濃度為 4 4 μmol·L－1。觀察記錄藥物作用3 min時氣管條的張力值，計算解痙百分率［解痙百分率/%=(給藥前張力值－給藥后張力值)/給藥前張力值×100%］。

1.2.4 對ACh誘導的收縮反應的影響 加入1.1 mmol·L－1氯化乙酰膽堿溶液，使其終濃度為11 μmol·L－1，待ACh引起氣管條最大收縮時，換液，洗氣管條5次，換液，待基線平穩后，再次加入ACh溶液，記錄標本的張力值，待其達到收縮峰值后，采用累積劑量法加入樣品溶液或空白對照溶液，或一次性加入陽性對照溶液44 mmol·L－1氨茶堿，其終濃度為44 μmol·L－1。觀察記錄藥物作用3 min時氣管條的張力值，計算解痙百分率。

2 結果

2.1 佛司可林和異佛司可林對離體豚鼠氣管條的影響

2.1.1 對His誘導的收縮反應的影響 氣管條在Kreb’s營養液中平衡后，加入His引起氣管條的收縮。空白組給藥前后差異無統計學意義，各給藥組均可明顯舒張His所致的的豚鼠氣管平滑肌的收縮，其中佛司可林在較低濃度(6.1、9.7 μmol·L－1)時舒張幅度不再增長，異佛司可林至更高濃度(9.7、24.4 μmol·L－1)時舒張幅度仍有增長趨勢，EC50值分別為(4.1 ±1.2)、(7.8 ±2.7)μmol·L－1，見 Fig 1。

Fig 1 Effects of forskolin，isoforskolin on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by His(±s，n=6)

2.1.2 對ACh誘導的收縮反應的影響 氣管條在Kreb's營養液中平衡后，加入ACh引起氣管條的收縮。空白組給藥前后差異無統計學意義，各給藥組均可明顯舒張ACh所致的的豚鼠氣管平滑肌的收縮，佛司可林與異佛司可林的舒張幅度隨濃度增加而增大，且均在較高濃度(24.4 μmol·L－1)時，舒張幅度隨濃度增加而僅有微小增大，最大舒張幅度佛司可林要大于異佛司可林，EC50值分別為(16.6±3.6)、(73.4 ±23.6)μmol·L－1，見 Fig 2。

2.2 佛司可林G、J、A、I對His誘導的離體豚鼠氣管條收縮反應的影響 氣管條在Kreb's營養液中平衡后，His引起了氣管條的收縮。空白組給藥前后差異無統計學意義，各給藥組均可明顯舒張His所致的的豚鼠氣管平滑肌的收縮，其中佛司可林G、J、A、I舒張幅度隨濃度增加而增大，最大舒張幅度從大到小依次為佛司可林 J、G、A、I，佛司可林 G、J、A、I的 EC50值分別為(18.8 ±4.5)、(7.1 ±6.2)、(24.3 ±12.1)、(64.7 ±9.5)μmol·L－1，見 Fig 3。

Fig 2 Effects of forskolin，isoforskolin on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by ACh(±s，n=6)

Fig 3 Effects of forskolinG，J，A，I on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by His(±s，n=6)

2.3 6 種佛司可林類化合物對His誘導的收縮反應影響的比較 繪制各化合物的量效關系曲線(Fig 4)，可觀察到各給藥組均可明顯舒張His所致的豚鼠氣管平滑肌的收縮，佛司可林、佛司可林J、異佛司可林、佛司可林G使氣管平滑肌的舒張分別在濃度為 6.1、11.0、12.0、36.7 μmol·L－1時不再增長，而佛司可林A、佛司可林I在累積濃度為45.9 μmol·L－1時氣管平滑肌的舒張仍呈增長的趨勢。其舒張作用的排列(效價由大到小):佛司可林，佛司可林J，異佛司可林，佛司可林G，佛司可林A，佛司可林I。

3 討論

氣管平滑肌上主要分布有β2受體、M受體和H1受體。β2受體興奮使支氣管平滑肌舒張，M受體和H1受體興奮使平滑肌收縮。His通過H1受體興奮而發揮作用，H1受體興奮可使支氣管平滑肌收縮，His參與哮喘有關的反應大多由H1受體介導。ACh是M受體激動劑，它可以通過與G蛋白偶聯，致磷脂酶C活化，產生1，4-肌醇三磷酸，誘發儲存于內質網中Ca2+的釋放，引起氣道平滑肌收縮，產生支氣管痙攣［14－15］。

本實驗結果顯示，佛司可林和異佛司可林對His、ACh刺激收縮下的離體氣管螺旋條有明顯的舒張作用，且隨著濃度的加大而有所增長，推測兩者均可能具有拮抗His、ACh的作用。比較其最大舒張幅度，在His組異佛司可林高于佛司可林，而在ACh組異佛司可林低于佛司可林;比較其解痙EC50，則異佛司可林均小于佛司可林。

佛司可林G、J、A、I這4個化合物對由His誘導引起的離體豚鼠氣管條收縮也均有明顯的舒張作用，亦隨著濃度的增加而有所增加，推測均可能具有拮抗His的作用。與異佛司可林、佛司可林相比較，最大舒張幅度由大到小依次為佛司可林J、異佛司可林、佛司可林A、佛司可林、佛司可林G、佛司可林I，EC50從大到小依次為佛司可林、異佛司可林、佛司可林J、佛司可林 G、佛司可林I、佛司可林 A(Fig 4)。以上6個化合物的平喘作用機制，有待進一步研究。

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