海地瓜硫酸軟骨素對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響

龍騰騰，王靜鳳，常耀光，賀 敏，武鳳娟，王玉明，薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

肥胖癥是指體內脂肪積聚過多和(或)分布異常、體重增加，是導致Ⅱ型糖尿病以及冠心病、高血壓、慢性腎衰等代謝綜合征的重要危險因子［1－2］。脂肪合成的過程包括前脂肪細胞的增殖和分化，在分化過程中，PPARγ、C/EBPα和 SREBP-1c等調控脂肪合成相關基因的表達，對脂肪積蓄起關鍵作用［3］。因此，抑制前脂肪細胞的增殖和分化可減少機體脂肪的儲存，是治療或預防肥胖的策略之一。

海參多糖是海參體壁的重要功效成分之一，包括海參硫酸軟骨素和海參巖藻聚糖硫酸酯兩種組分［4］。其中，海參硫酸軟骨素(sea cucumber chondroitin sufate，SC-CHS)是一種具有硫酸巖藻糖支鏈的類硫酸軟骨素，主要由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖組成的分子雜多糖。近年來研究表明，海參硫酸軟骨素具有抗腫瘤、提高機體免疫力、抗凝血、抗病毒等生理功效［5］，尚未發現其降脂功效的相關報道。

本文以體外培養的小鼠3T3-L1前脂肪細胞為研究對象，檢測AM-CHS對其增殖和分化的抑制作用，并對作用的靶時期和作用機制進行探討，以期為新型海洋功能食品的開發和低值海參的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 海地瓜(Acaudina Molpadioides)干品，購自青島市南山集貿市場;3T3-L1前脂肪細胞，購自 American Type Culture Collection公司;DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)培養基、小牛血清(Calf Serum，CS)由美國Gibco公司提供;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、胰島素(insulin)、地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰蛋白酶、油紅 O染料，由美國Sigma公司提供;Taq酶、MMLV由日本TaKaRa公司提供;甘油三酯(Triglycerides，TG)測定試劑盒，由北京普利萊基因技術有限公司提供;小鼠過氧化物酶體增殖體激活受體(PPARγ)、CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)、固醇調節元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)及β-actin引物，由上海生工生物技術公司提供;其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司);2711型CO2培養箱(德國Heraeus公司);TGL-16G型臺式離心機、WGP-300型隔水恒溫培養箱(上海安亭科學儀器廠);DL-CJ-1N型超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司);HH-8型數顯恒溫水浴鍋(金壇市雙捷實驗儀器廠);TC-96 Life Pro基因擴增儀(杭州博日科技公司);JS-780全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技公司);IX51倒置顯微鏡系統(Olympus公司)。

1.3 AM-CHS的制備 海地瓜干品粉碎，丙酮脫脂。用木瓜蛋白酶在60℃水浴下酶解24 h，加入10%的CPC溶液沉淀出粗多糖。粗多糖溶解于3 mol·L－1NaCl∶乙醇(100 ∶15V/V)中，加入 95%乙醇調溶液醇度至45%，4℃放置24 h，離心取上清。上清調醇度至75%，過夜取沉淀，得CHS粗品。CHS粗品過DEAE-52陰離子交換柱，以0～1.4 mol·L－1NaCl連續梯度緩沖鹽溶液進行洗脫，每7 ml收集一管。洗脫液過液相TSK4000柱子，檢測組分單一的管，收集后透析，真空冷凍干燥，得AM-CHS純品［6］。

1.4 3 T3-L1前脂肪細胞的培養與分化 3T3-L1前脂肪細胞培養于含體積分數為10%小牛血清的DMEM培養基，其中含1×105U·L－1青霉素和1×105μg·L－1硫酸鏈霉素。以0.25%的胰酶消化傳代，于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中常規傳代貼壁培養。

取對數生長期的3T3-L1前脂肪細胞，用DMEM完全培養基調細胞濃度接種于培養板內。待細胞融合后接觸抑制48 h(此時為誘導分化的0 d)，換用含 0.5 mmol·L－1IBMX、1 μmol·L－1DEX、10 mg·L－1胰島素的完全培養基培養48 h，再換用含10 mg·L－1胰島素的完全培養液培養48 h，以后每2 d更換1次完全培養液，并于d 8進行脂肪含量檢測。

1.5 AM-CHS對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響 取密度為2×107·L－1的3T3-L1前脂肪細胞懸液接種于96孔板內，每孔100 μl。24 h后棄培養基，加入含不同濃度AM-CHS的完全培養基(分別為 0、50、100 和 200 mg·L－1)，每孔 200 μl，每個濃度4個復孔，分別培養24、48、72和96 h。于實驗結束前4 h加MTT，繼續培養4 h后吸棄培養基，加入酸化異丙醇200 μl/孔，吹打至藍色結晶完全溶解，于酶標儀570 nm處測定吸光度A值，細胞增殖活性以樣品組A值/對照組A值×100%表示。

1.6 AM-CHS對不同分化時期的3T3-L1脂肪細胞增殖活性的影響 取密度為2×107·L－1的3T3-L1前脂肪細胞懸液接種于96孔板內，每孔200 μl。誘導細胞分化方法如“1.4”所述，分別在細胞分化的早期(0 d)、中期(2 d)、晚期(4 d)加入不同濃度的 AM-CHS(分別為 0、50、100 和 200 mg·L－1)，并在d 8用MTT法于570 nm處測定吸光度A值，并計算樣品組A值/對照組A值×100%。

1.7 AM-CHS對3T3-L1成熟脂肪細胞增殖活性的影響 取密度為2×107·L－1的3T3-L1前脂肪細胞懸液接種于96孔板內，每孔200 μl。誘導細胞分化方法如“1.4”所述，在分化后的d 8加入不同濃度的 AM-CHS(分別為 0、50、100 和 200 mg·L－1)，分別培養24、48、72和96 h，MTT法于570 nm 處測定吸光度A值，并計算樣品組A值/對照組A值×100%。

1.8 AM-CHS對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

取密度為3×107·L－1的3T3-L1前脂肪細胞懸液接種于24孔板內，每孔1 ml。誘導細胞分化方法如“1.4”所述，分別在細胞分化的早期(0 d)、中期(2 d)、晚期(4 d)加入不同濃度的AM-CHS(分別為0、60、120和240 mg·L－1)，將誘導分化8 d的脂肪細胞用10%多聚甲醛固定1 h，0.5%油紅O染色30 min后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。加入異丙醇溶解脂肪細胞中的油紅O，于490 nm波長下檢測吸光度值，半定量檢測細胞內的脂肪含量［7］。

將誘導分化8 d的脂肪細胞用PBS洗3次去除釋放的甘油，加入細胞裂解液并超聲破碎，離心取上清，參照試劑盒檢測TG含量。

1.9 Real time PCR 檢測 PPARγ、C/EBPα 和SREBP-1c mRNA的表達 3T3-L1細胞分化干預方法如“1.8”所述，于分化的d 8收集細胞，采用Trizol法提取總RNA。取1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，采用30 μl反應體系進行PCR擴增。反應體系包括 500 ng cDNA、45 mmol·L－1MgCl2、3 μl 10 ×緩沖液、12 mmol· L－1dNTPs、6 μmol 引物、3U TaqDNA聚合酶。PCR反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性 45 s，退火 30 s，72℃延伸 45 s，最后72℃延伸10 min，不同基因的引物序列、退火溫度和循環數見Tab 1。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，并進行條帶的灰度掃描，以β-actin作為內參校正，目的基因的相對表達量以目的基因灰度值/β-actin灰度值×100%表示。

1.10 統計學分析 數據分析采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，同時進行LSD兩兩比較，實驗結果用±s表示。

2 結果

2.1 AM-CHS對分化不同時期3T3-L1細胞增殖活性的影響 結果如Fig 1所示，與正常組相比，AM-CHS能明顯抑制3T3-L1前脂肪細胞(Fig1A)的增殖，其96 h的抑制率達到18.73%(P＜0.01)。AM-CHS可明顯抑制3T3-L1成熟脂肪細胞(圖1C)的增殖，其72 h和96 h的平均抑制率分別為20.40%(P＜0.01)和21.61%(P＜0.01)。AMCHS對分化不同時期3T3-L1細胞(Fig 1B)的增殖均無明顯性影響。說明AM-CHS對3T3-L1前脂肪細胞和成熟脂肪細胞有高度的靶向性，而并不影響分化過程中的3T3-L1細胞數目。

Tab 1 Primer sequences，annealing temperature and cycles of different genes

2.2 AM-CHS對分化不同時期3T3-L1脂肪細胞成脂的影響 如Fig 2所示，正常組細胞呈現典型的脂肪細胞表型，90%以上的細胞富含脂滴。分別在分化的d 0和d 2加入AM-CHS均可明顯抑制3T3-L1細胞分化，細胞的脂滴明顯減少，與正常組相比，其平均抑制率分別為27.82%(P＜0.01)和12.14%(P＜0.01);另外，d 0加樣后抑制分化作用呈現量效關系，200 mg·L－1AM-CHS處理組抑制作用最強，抑制率達到33.26%(P＜0.01)。當d 4加入AM-CHS后對3T3-L1細胞分化作用影響甚微，差異未見顯著性。提示海地瓜AM-CHS能明顯抑制3T3-L1細胞的分化，減少脂質聚集，以早期抑制作用最強。

2.3AM-CHS對PPARγ mRNA表達水平的影響

過氧化物酶體增殖體激活受體(PPARγ)是脂肪細胞特異性的轉錄因子，能轉錄、激活脂肪酸結合蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等脂質合成基因的表達而促進脂滴聚集，在脂肪細胞分化和脂肪生成中起關鍵作用。

Fig 1 Effects of AM-CHS on the proliferation activities of 3T3-L1 cells at different time(n=6)

由Fig 3可見，分化d 0和d 2的3T3-L1細胞經AM-CHS干預后，其PPARγ mRNA表達量明顯降低(P＜0.01)，較正常對照組平均降低了58.14%(P＜0.01)和40.78%(P＜0.01)。分化d 4干預后，PPARγ mRNA表達量較正常對照組降低了13.49%，但差異無顯著性。提示AM-CHS可以通過降低分化關鍵基因PPARγ mRNA的表達，抑制3T3-L1細胞的分化，且干預的最佳時期是分化早期。

2.4 AM-CHS對C/EBPα mRNA表達水平的影響 CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)在脂肪細胞分化中具有促進PPARγ的高表達，保持分化細胞表型的作用［8］。Fig 4顯示，在3T3-L1細胞分化的d 0、2、4分別加入 AM-CHS后，其 C/EBPα mRNA 表達量均明顯降低，分別較正常對照組平均降低了67.95%(P＜0.01)、42.78%(P＜0.01)和 37.87%(P＜0.01)。其中，AM-CHS對3T3-L1細胞分化早期的干預作用最為明顯。

2.5AM-CHS對SREBP-1c mRNA表達水平的影響 固醇調節元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)能夠激活關鍵生脂基因而增加脂肪酸和脂肪的合成，在脂肪細胞分化中起重要的正調控作用。Fig 5顯示，在3T3-L1細胞分化的d 0、2、4加入AM-CHS干預后，其SREBP-1c mRNA表達量均明顯降低，分別較正常對照組平均降低了58.47%(P＜0.01)、45.12%(P＜0.01)和28.56%(P＜0.01)。提示 AM-CHS可以通過抑制SREBP-1c mRNA的表達從而抑制3T3-L1細胞的分化，且早期干預抑制作用最強。

3 討論

脂肪細胞的分化過程伴隨著細胞數量增加、體

積增大及TG聚積［9］。當前脂肪細胞數目過度增多和分化失常時可引起脂肪組織堆積，繼而導致肥胖的發生［10］。因此抑制前脂肪細胞的增殖和分化是抗肥胖的一個重要思路。近年來脂肪細胞分化的調控及其與肥胖發病機制的關系一直是國內外的研究熱點。本實驗以體外培養的3T3-L1前脂肪細胞為研究對象，研究AM-CHS對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響以及作用機制的初探。結果表明，AM-CHS能明顯地抑制3T3-L1細胞的增殖和分化，減少脂肪細胞分化過程中脂質的堆積。提示AMCHS可能具有潛在的減肥降脂效應。

Fig 2 Effects of AM-CHS on the degree of differentiation of 3T3-L1 cells at different time(n=6)

Fig 3 Effects of AM-CHS on the PPARγ mRNA expression level of 3T3-L1 adipocytes at different time(n=6)

Fig 4 Effects of AM-CHS on the C/EBPα mRNA expression level of 3T3-L1 adipocytes at different time(n=6)

脂肪細胞分化是一個高度精細的調控過程，受到激素、基因和信號轉導通路的調控。目前研究認為，PPARγ、C/EBPα和 SREBP-1c 3者是調節脂肪形成最主要的轉錄因子。

PPARγ是特異性表達于脂肪組織中的核轉錄因子，主要調節與脂肪酸代謝相關基因的表達，最終促進脂肪的合成。Kadowaki等［11］研究表明，雜合的PPARγ基因缺失小鼠在高脂飲食情況下不會發生肥胖，說明降低PPARγ表達能防止高脂飲食引起的脂肪細胞過度肥大。本研究結果顯示，AM-CHS能明顯抑制PPARγ mRNA的表達，說明抑制PPARγ的表達是AM-CHS抑制3T3-L1前脂肪細胞分化的有效途徑之一。

Fig 5 Effects of AM-CHS on the SREBP-1c mRNA expression level of 3T3-L1 adipocytes at different time(n=6)

C/EBPα屬于亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，可誘導成纖維細胞中的脂肪形成。活化的C/EBPα不僅能促進自身的表達增加，而且還能夠與PPARγ起協同作用，共同誘導細胞分化。Wu等［12］研究表明C/EBPα的異位表達可誘導成纖維細胞中的脂肪形成，而反義表達則抑制前體脂肪細胞分化，說明C/EBPα在調控脂肪合成方面起正調控作用。本研究結果顯示，AM-CHS能通過抑制脂肪細胞分化相關基因C/EBPα mRNA的表達而抑制3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化。

SREBP是一種能和固醇調節元件特異性結合的核轉錄因子，在調控膽固醇、脂肪酸和甘油三酯合成方面起重要作用。Kim等［13］已證明SREBP-1c能夠通過PPARγ啟動子中的E盒基序促進內源性PPARγ的產生，并與 PPARγ和 C/EBPα共同調控脂肪細胞的分化。Shimano等［14］研究表明，SREBP-1c缺失的小鼠中促進脂質合成的基因表達量下降，脂肪含量明顯降低。本研究結果顯示，AM-CHS能明顯抑制 SREBP-1c mRNA的表達，繼而抑制PPARγ和 C/EBPα的表達，具有直接抑制3T3-L1前脂肪細胞分化的作用。

綜上所述，AM-CHS可明顯抑制3T3-L1前脂肪細胞和成熟脂肪細胞的增殖，抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，其機制與下調分化關鍵基因PPARγ、C/EBPα和SREBP-1c mRNA的表達有關，其中干預早期抑制作用最強。但其如何作用于PPARγ、C/EBPα 和 SREBP-1c，作用后其下游相關基因如何表達變化以及信號通路還有待于進一步研究。

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