姜黃素對人正常肝細胞角蛋白1和內質網蛋白19表達的影響

周中運，范春雷，竇曉兵，胡林峰，錢 穎

(浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江杭州 310053)

姜黃素(Curcumin，CUR)是從姜科姜黃屬(Curcuma longaL.)植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取得到的一種植物多酚，也是中藥姜黃發揮藥理作用的重要活性成分。系列研究表明CUR具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等多種生物學效應［1－5］。近年來姜黃素已成為國內外的研究熱點，涉及的研究領域也越來越廣泛。本研究以人正常肝細胞(L-02)作為實驗對象，應用雙向凝膠電泳和質譜技術初步研究CUR對人正常肝細胞蛋白質組的影響，從中篩選出表達量變化最大的兩種蛋白質分別為角蛋白1(Cytokeratin 1，CK1)和內質網 蛋 白 19(Endoplasmicreticulum protein 19，ERp19)，用Western blot進一步進行驗證，從蛋白質表達水平上探討CUR藥理作用的分子機制，也為揭示CUR藥理作用分子機制提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 人正常肝細胞L-02細胞系(中國科學院上海細胞研究所);姜黃素(批號20100609)購自上海三愛思試劑有限公司;固相pH梯度膠條 (IPG strip pH 4-7，24 cm)(批號922804E)均購自 Bio-Rad Laboratories公司;2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒(批號0807-03)購自GE healthcare公司;兔抗人抗體(CK1)(批號 bs-1244R)購于BIOSS公司，兔抗人抗體(ERp19)(批號O95881)購于Abcam公司。EttanTMIPGphorTM等電聚焦電泳儀，EttanTM DALTSix垂直板電泳儀，UMAX ImageScanner凝膠掃描儀，Image Master 2D Platinum 6.0雙向電泳凝膠圖像分析軟件，均購自Amersham BioSciences公司，Biofuge stratos高速冷凍離心機為德國Heraeus公司產品，UV8200分光光度計為日本日立公司產品，飛行時間串聯質譜儀MALDI TOF/TOFTMAnalyzer 4800購自美國應用生物系統公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用10%的滅活胎牛血清、含青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養液在37℃、5%CO2條件下培養，待細胞呈對數生長時即開始實驗。隨機將人正常肝細胞L-02分成兩組，對照組不作任何處理，姜黃素組以 25 mol·L－1［6－7］姜黃素處理 L-02細胞24 h。

1.2.2 細胞總蛋白提取 24 h后，分別收集兩組細胞于試管中，各加入2 ml細胞裂解液(30 mmol·L－1Tris，8 mol·L－1尿素，4%CHAPS，pH 8.5)，4℃孵育1 h。置冰上超聲，超聲后用4℃，12 000 r·min－1離心30 min，取上清用2-D Quant Kit測定蛋白質濃度，置－80℃保存。

1.2.3 雙向電泳 將各組蛋白質的樣品和水化液(8 mol·L－1尿素，2%CHAPS，13 mmol·L－1DTT，0.5%IPG buffer，0.002% 溴酚藍)混合后共 450 μl(每塊膠蛋白質上樣量為300 μg，每組做3塊重復膠)，制成第一向等電聚焦體系，采用膠內泡漲的方法上樣。等電聚焦的參數:30 V，12 h;500 V，1 h;1000 V，1 h;8 000 V，8 h。等電聚集后，膠條于平衡液Ⅰ(1%DTT，50 mmol·L－1Tris-HCl，6 mol·L－1尿素，30%甘油，2%SDS，0.002% 溴酚藍)、平衡液Ⅱ(4% 碘乙酰胺，50 mmol·L－1Tris-HCl，6 mol·L－1尿素，30% 甘油，2%SDS，0.002% 溴酚藍)中各平衡15 min后轉移到第二向已制好的12.5%SDSPAGE膠上，用0.5%瓊脂糖封頂，進行第二向電泳，電泳參數設定為:30 W，45 min;90 W，6 h。直到溴酚藍染料遷移至膠的底部邊緣結束電泳。

1.2.4 圖像掃描分析 電泳結束后，取出凝膠轉移到染色盒里進行硝酸銀染色。所得的蛋白質組圖譜使用UMAX ImageScanner凝膠掃描儀及LabScan軟件進行掃描。然后用Image Master 2D Platinum 6.0分析，進行點識別、背景消除、點匹配及差異蛋白質分析，獲得兩組比較后的差異蛋白質點。

1.2.5 差異蛋白點的質譜鑒定 從膠內挖取某些差異蛋白點后，進行脫色、膠內胰酶酶切和肽段提取，然后用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行肽質量指紋圖譜分析。通過Mascot軟件，在蛋白質數據庫中搜索與肽質量指紋圖譜數據相匹配的蛋白質，從而鑒定出有差異的蛋白質。

1.2.6 Western blot鑒定 取用上述已經定量的兩組細胞總蛋白樣品融解，蛋白樣品先用10%SDSPAGE凝膠進行分離，然后用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉對膜進行封閉，按照蛋白Mark標志將膜裁剪，分別用1∶400的CK1和1∶5 000的ERp19兔抗人一抗孵育，1∶4 000羊抗兔的二抗孵育，ECL顯色，凝膠成像系統對圖像進行采集。

1.2.7 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件分析數據，實驗數據以±s表示，采用方差分析比較各組間差異。

2 結果

2.1 雙向銀染圖譜的分析 銀染蛋白質圖譜經Image Master 2D Platinum 6.0軟件分析后，經比較結果發現，對照組3塊凝膠的平均蛋白質點數為521個，姜黃素作用后3塊凝膠的平均蛋白質點數為587個。兩組比較，如果蛋白質表達的量差異超過1倍(增加或者降低)，并且3塊膠中蛋白質表達量變化的趨勢相一致，則被認為該蛋白質表達差異是由藥物所引起，而不是樣品材料和操作過程所帶來的誤差。根據這個原則，共找到40個差異蛋白點，其在圖譜中的位置見Fig 1。

Fig 1 2-DE silver-staining patterns(pH 4－7，24 cm，Nonlinear strip)

2.2 差異表達點的質譜鑒定 上述差異蛋白質點經過膠內酶解后用MALDI-TOF-MS對其中差異最大的兩個蛋白質進行鑒定，并與蛋白質文庫進行比對分析后，這兩個蛋白的分子量與等電點被確定見Tab 1。結果顯示:姜黃素處理后角蛋白1和內質網蛋白19表達均增高。

Tab 1 MS identified results of differentially expressed proteins

2.3 Western blot分析 Western blot結果表明人肝細胞L-02經姜黃素處理后角蛋白1和內質網蛋白19表達均明顯增高，與雙向質譜鑒定的上調趨勢基本相同(Fig 2)。

3 討論

傳統中醫中姜黃具有破血行氣、通經止痛的功能，用于胸脅刺痛，閉經，風濕肩臂疼痛等。以往的大量研究也表明［7－8］，姜黃的主要活性成分姜黃素具抗氧化、抗腫瘤、抗炎以及對心血管系統、消化系統等多方面藥理作用。肝臟是體內重要的代謝器官，肝細胞在其過程中發揮了主要的作用。機體中多種抗氧化的酶類及其它重要的活性因子主要是由肝細胞產生，而且進行生物氧化的線粒體也主要存在于肝細胞中。因此肝臟的保護顯得尤為重要，已有研究發現姜黃素對誘導的肝損傷具有保護作用［9－10］，本實驗室前期的研究表明，姜黃素能提高人肝癌細胞HepG2表面的低密度脂蛋白受體(LDLR)表達［6］，提示其對抗動脈粥樣硬化(AS)起積極的作用。但是，當姜黃素的濃度超過 30 μmol·L－1［6］后，則它能夠抑制 HepG2 細胞的生長，表明姜黃素也具有抗腫瘤的作用。本實驗從蛋白質組學角度，應用雙向凝膠電泳、質譜技術和蛋白免疫印跡來探討姜黃素對人正常肝細胞的作用機制，結果發現了2個明顯差異蛋白質角蛋白1和內質網蛋白19。

Fig 2 Effects of curcumin on expression of CK1 and ERp19

角蛋白(keratin)是最大的中間纖維亞組，分屬Ⅰ型和Ⅱ型中間纖維蛋白，目前已發現有50余種，主要分布于上皮組織細胞中［11－12］。在分化過程中，伴隨著各種角蛋白的基因表達改變，其中存在于基底上層的角蛋白1常被作為早期正常分化的標志［13］。硫氧還蛋白(Trx)被認為是除GSH和SOD系統之外的另一個內源性抗氧化系統，硫氧還蛋白結構域是內質網蛋白19中主要的結構域，Trx是一個控制細胞氧化還原狀態的、廣泛表達的小分子蛋白質，通過其活性中心硫氫鍵和二硫鍵的可逆轉換參與細胞內的氧化還原過程［14］。

通過本實驗研究表明，加入姜黃素藥物組與空白對照組的蛋白質差異明顯，其中表達量變化最大的角蛋白1和內質網蛋白19明顯上調。角蛋白1具有促分化作用，對于癌細胞以分裂為主的特性有抑制作用，能使癌細胞分裂降低，趨向分化;內質網蛋白19中的硫氧還蛋白結構域具有抗氧化作用。因此上調肝細胞角蛋白1和具硫氧還蛋白結構域的內質網蛋白19可能是姜黃素抗腫瘤、抗氧化作用的機制之一。

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