EGCG對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖抑制作用及機制

魏 芳，劉 浩，張 配，蔣國君，馬琳艷，陳 超

(蚌埠醫學院藥學系，安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽蚌埠 233030)

三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體2(HER2)均不表達的乳腺癌亞型。有報道其生物學行為具有高侵襲性、惡性程度高、治療棘手等特點［1］。患此型乳癌的病人無法從內分泌治療和抗HER2的靶向治療中獲益，因此化療在TNBC的全身治療中起重要作用［2］。如何提高此類患者的治療效果，篩選治療三陰乳腺癌的天然藥物是醫學臨床和基礎研究的熱點。茶葉作為一種傳統的“醫食同源”的保健飲料，同時也是一種常用的中藥，其具有多種生物學活性和藥理效應，如抗突變、抗腫瘤、抗炎抗病毒及清除自由基和抗氧化等作用。經研究發現這些作用主要是由茶多酚介導的，包括黃烷醇、黃烷雙醇、黃酮類和茶多酚酸類，其中大部分是黃烷醇，通稱為兒茶素［3］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(－)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是茶葉特有的兒茶素，其含量最高，約占兒茶素的50%左右，而且生物活性最強［4］。本實驗旨在研究EGCG對體外培養的三陰乳腺癌細胞MDAMB-231的增殖抑制作用，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料

1.1 細胞株、主要試劑及儀器 人乳腺癌細胞MDA-MB-231，由中山大學藥學院藥理學實驗室惠贈。DMEM培養基、胰酶購自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青工程材料有限公司、EGCG、Hoechst 33258染色試劑盒購自Sigma公司，CCK-8檢測試劑盒，Caspase-3檢測試劑盒、JC-1檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。GRP78、caspase-3單克隆抗體為Santa Cruz公司產品，β-actin單克隆抗體為艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司產品，辣根過氧化物酶標記的二抗為武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 CO2培養箱(美國熱電公司);倒置熒光顯微鏡IX-71(日本Olympus公司);BioTek酶標儀(德國Synergy HT公司);Milli-Q Biocel超純水儀(美國Millipore公司);Mini-Prote電泳儀(美國伯樂公司)圖像采集系統(日本Olympus公司);細胞培養板(美國Corning公司)。

2 方法

2.1 細胞培養及藥液配制 MDA-MB-231細胞常規培養于含10%滅活新生牛血清、100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。EGCG以DMEM培養液稀釋至終濃度使用。

2.2 CCK-8法檢測細胞的增殖抑制率 實驗設空白對照組，細胞對照組，10、20、40、80、160 mg·L－1EGCG 5個濃度處理組每組設3個復孔，取對數生長期的MDA-MB-231細胞，0.25%胰酶溶液充分消化后用DMEM培養液稀釋成單細胞懸液，調整細胞密度為2×107·L－1，細胞對照組和藥物處理組每孔加入細胞懸液100 μl，空白對照組加入100 μl培養液接種于96孔培養板，接種過程細胞懸液保持吹打和晃動使細胞分布盡量均勻，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h待細胞貼壁后，棄掉原培養基，向每孔加入含藥培養基100 μl放入培養箱內繼續培養 12、24、48 h 作用結束后，加入10 μl的 CCK-8，在培養箱內培養60 min后，在酶標儀450 nm波長處測定吸光度(A)值，計算腫瘤細胞存活率。腫瘤細胞存活率/%=(處理組A值－對照組A值)/(對照組A值－空白對照組A值)×100%，通過IC50計算軟件計算IC50值，實驗重復3次。

2.3 Hoechst33258染色法觀察細胞凋亡的形態學改變 取對數生長MDA-MB-231細胞，以 1×105個/孔的密度接種于6 孔培養板，20、40、80 mg·L－1EGCG作用24、48 h后，吸出培養液，PBS漂洗1次，加4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS漂洗2次，加入1 ml終濃度為10 mg·L－1的 Hoechst33258染色液，避光染色30 min，PBS漂洗2次，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，實驗重復3次。

2.4 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)檢測 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。取對數生長期細胞加入20、40、80 mg·L－1EGCG 作用24、48 h 后，PBS 洗兩遍，按試劑盒說明加入1 ml細胞培養液和1 ml JC-1染色工作液混勻，37℃孵育20 min，孵育結束后用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入培養液，冰浴保存，30 min內在熒光顯微鏡觀察，JC-1單體的最大激發波長為514 nm，最大發射波長為529 nm;JC-1聚合物的最大激發波長為585 nm，最大發射波長為590 nm，實驗重復3次。

2.5 caspase-3活性檢測 caspase-3活性檢測試劑盒采用分光光度法檢測細胞裂解液中caspase-3活性。casepase-3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產生黃色的pNA(p-nitroani-line)，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase-3的活性，具體檢測步驟參照試劑盒說明書進行，實驗重復3次。

2.6 Western 印跡法檢測 GRP78、caspase-3 蛋白的表達 取對數生長期MDA-MB-231細胞，制成單細胞懸液，8×105個/孔，加入不同濃度EGCG作用48 h后，終止培養，收集細胞，4℃預冷的PBS洗滌細胞3次，加入75 μl細胞裂解液，冰上裂解30 min后，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。確定上樣蛋白約30 μg，10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，50 V濕轉120 min轉至PVDF上，用5%脫脂牛奶的封閉液4℃封閉過夜。洗膜后，加入兔抗GRP78抗體(1∶500稀釋)過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000稀釋)反應2 h。按照MILLIPORE公司Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒說明，將化學發光增強液A和B兩種試劑等體積混勻涂抹于PVDF膜上。用Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像，實驗重復3次。

2.7 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，結果以±s表示，組間差異采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 EGCG對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用 實驗中觀察了5個濃度的EGCG在3個不同時間點對MDA-MB-231細胞增殖抑制的量效和時效關系，結果表明 10、20、40、80、160 mg·L－1EGCG作用隨著其濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低，見Fig 1。作用12、24、48 h后的IC50分別為 69.1、40.4、29.4 mg·L－1。

Fig 1 Effects of EGCG on cell viability of MDA-MB-231

3.2 Hoechst33258染色觀察EGCG作用后細胞凋亡的形態 Hoechst 33258染色觀察，對照組細胞核形態正常，細胞發出淡藍色熒光，染色均勻，隨著EGCG濃度的增加，逐漸出現各期凋亡細胞形態:細胞核皺縮變形，染色質濃集，部分細胞呈現致密濃染，呈現高度凝聚、邊緣化，甚至裂解為碎塊，產生凋亡小體，且中濃度和高濃度組在細胞數量上也明顯減少(Fig 2)。

Fig 2 The morphological changes of MDA-MB-231 apoptosis induced by EGCG(stained with Hoechst 33258 ×200)

3.3 EGCG對MDA-MB-231細胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以檢測到細胞膜電位的下降。結果顯示:EGCG刺激MDA-MB-231細胞24 h后，隨著濃度的增加，與陰性對照和陽性對照藥CCCP作用后相比40，80 mg·L－1EGCG組紅色熒光向綠色熒光轉變較明顯(Fig 3)。

3.4 EGCG對MDA-MB-231細胞caspase-3活性的影響 通過caspase-3活性檢測試劑盒對EGCG作用48h后caspase-3的活性進行檢測，結果表明:EGCG低濃度作用時caspase-3的活性激活不明顯，中、高濃度EGCG均可明顯增強caspase-3的活性(Fig 4)。

3.5EGCG 對 MDA-MB-231 細胞 GRP78、caspase-3蛋白表達的影響 40、80 mg·L－1EGCG作用48 h后通過Western blot檢測GRP78、caspase-3蛋白表達情況，從見Fig 5可看出，EGCG隨著劑量的增加可明顯抑制GRP78蛋白的表達，而活性caspase-3蛋白表達是明顯增強的。

Fig 3 Effects of EGCG on mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231(stained with JC-1 ×200)

4 討論

TNBC占所有乳腺癌患者的15% ～20%，在我國近1/4患者為三陰乳腺癌。TNBC具有侵襲性高、惡性程度高、易轉移和復發、預后差、生存率低等特點。目前對于TNBC在臨床上仍然沒有統一的標準治療方案，關于TNBC治療的靶點和靶向藥物研究也非常有限［5］。

很多研究表明［6－9］EGCG在體內體外具有較好的抗腫瘤作用，本實驗觀察了EGCG對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、細胞凋亡、線粒體膜電位變化以及葡萄糖調節蛋白78(glucose regulatd protein 78，GRP78)和活性caspase-3表達的影響，結果表明EGCG能明顯抑制MDA-MB-231細胞增殖，促進其凋亡。

Fig 4 Effects of EGCG on activities of caspase-3 in MDA-MB-231

文獻報道［10－11］，抗癌藥物誘導細胞凋亡的機制主要有線粒體介導的內源性途徑和死亡受體誘導的外源性途徑。腫瘤細胞由于生長旺盛常處于糖缺乏，酸中毒和低氧狀態，導致細胞中低糖基化，未折疊蛋白在內質網中積聚，產生內質網應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)。GRP78 是細胞內質網內分泌的一種蛋白，是公認的ERS中最重要、最具有代表性的應激蛋白之一，其作為內質網中主要的分子伴侶，參與新合成蛋白質的轉運和高級結構折疊及跨內質網膜轉運。當腫瘤細胞處于ERS時，GRP78 大量表達［12］，目前許多研究證實［13－14］，在肺癌、肝癌等多種腫瘤細胞中，ERS誘導通路的持續活化可抑制腫瘤細胞凋亡、促進細胞的侵襲和轉移，引起對化療藥物的耐藥性增加。有文獻報道［15－17］，下調GRP78可逆轉腫瘤多重耐藥，降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力。因此，抑制腫瘤細胞發生過強的ERS可能是治療腫瘤更有前景的潛在靶點［18－19］。

Fig 5 Effects of EGCG on expression of GRP78 and a-caspase-3 in MDA-MB-231

本研究發現40，80 mg·L－1EGCG刺激 MDAMB-231細胞48h明顯下調了GRP78的表達，提示EGCG所引起的細胞凋亡可能與抑制了MDA-MB-231細胞過度的ERS有關。

綜上，本實驗證實了EGCG能明顯抑制三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖，其機制可能與抑制GRP78蛋白表達，增強caspase-3活性誘導其凋亡有關。那么EGCG能否通過抑制ERS增強三陰乳腺癌對化療藥物的敏感性，其機制如何，還需要進一步通過實驗深入研究，以期為臨床聯合應用化療藥物治療三陰乳腺癌提供實驗基礎和聯合用藥策略。

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