枸杞多糖對NMDA致大鼠視網膜損傷保護作用的研究

白 雙，于 鑫，杜瑛培，鄭 萍，2，鄭 婕，2，閆 琳，2，戴貴東

(1.寧夏醫科大學藥學院2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心3.寧夏醫藥研究所;寧夏銀川 750004)

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide，LBP)是從寧夏特色回藥材枸杞的干燥成熟果實中提取所得。已有文獻報道［1－3］，枸杞多糖具有抗氧化、防衰老、抗輻射等多種生物學活性，尤其是對急性眼高壓、糖尿病眼病等視網膜損傷具有保護作用。本實驗旨在通過建立NMDA致大鼠視網膜損傷動物模型，研究枸杞多糖的保護作用及可能機制，為臨床視網膜損傷疾病防治提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 清潔級♂Sprague-Dawley大鼠，7～8周齡，體質量120～150 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(寧)2012-0006

1.2 藥品與試劑 枸杞多糖購自寧夏沃福百瑞生物食品有限公司，含量≥30.0%，批號:64WFBR100501;戊巴比妥鈉、NMDA、氯化鈉、多聚甲醛均購自Sigma公司;凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司;兔抗大鼠eNOS、iNOS抗體購自Abcam公司;兔抗大鼠NMDAR2A抗體、兔抗β-actin抗體購自Cell Signaling公司;山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術公司。Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate購自Thermo Scientific公司;實驗用水為超純水。

1.3 儀器 TY96-ⅡN型超生細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);H1850R型臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);5 μl微量注射器(上海安亭微量進樣器廠);Mutiskan Go酶標儀(美國Thermo Fisher公司);PowerPac Basic電泳儀(美國BIO-RAD公司);培清JS-860B凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)。

2 方法

2.1 實驗動物分組及模型的建立 56只清潔級♂Sprague-Dawley大鼠隨機分為4組:NMDA組、NMDA+枸杞多糖(100、200 和400 mg·kg－1)組，每組14只大鼠。NMDA組大鼠的左眼為正常對照組。NMDA致大鼠視網膜神經元損傷模型，根據Kawasaki等采用的方法略為改進［4］，具體方法:各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉，采用微量注射器大鼠右眼玻璃體內注射2 μl濃度為40 nmol·L－1的 NMDA。枸杞多糖分別按100、200和400 mg·kg－1于NMDA注射前7天灌胃給藥，共14 d。模型組給予等體積生理鹽水。d14處死各組大鼠。每組取5只大鼠眼球剔除玻璃體縱切后浸入4%多聚甲醛固定，其余大鼠眼球剔除玻璃體后置液氮中速凍后放－80℃冰箱中凍存。

2.2 病理學組織觀察 多聚甲醛固定24 h后，用流水沖洗3 h，然后梯度乙醇脫水、常規石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色處理，每張切片隨機選取視神經根部周圍5個圓形視野，于顯微鏡下觀察視網膜內叢狀層厚度并對視網膜神經節細胞層的神經元進行計數。計數方法:同一倍率下，記錄視野中神經節細胞層長為100 μm(長度以標尺為準，平行于神經節細胞層方向)的任意區域內神經元個數，取平均值。

2.3 Western blot檢測 在約100 mg經液氮研磨的視網膜組織中加入0.5 ml冷裂解緩沖液，冰浴下超聲破碎細胞。4℃，10 000 r·min－1離心 10 min，取上清蛋白定量，剩余上清加入上樣緩沖液100℃水浴10 min，－20℃保存。取蛋白樣本75 μg上樣，7.5%SDS-PAGE凝膠電泳(80V/120V電壓)，200 mA恒定電流轉膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別用抗NMDAR2A抗體(1∶200)、抗eNOS抗體(1∶200)、抗iNOS抗體(1∶200)及抗βactin抗體(內參，1∶1 000)4℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(偶聯有HRP，1∶4 000)常溫孵育2 h，加入超級化學發光底物反應液，曝光膠片。膠片掃描結果采用Quantity-one軟件分析，將目的條帶的光密度值與其相對應的內參β-actin的光密度值相比以校正誤差，所得比值代表該目的蛋白的相對含量。2.4統計學處理實驗結果以±s表示。用SPSS 19.0軟件包進行統計分析。多組間均數的比較采用One-way ANOVA分析。

Fig 1 Effect of LBP on retinal damage in NMDA treated rats

3 結果

3.1 視網膜組織學改變 光鏡下正常對照組大鼠視網膜HE染色后各層組織結構清晰，完整，染色均勻，清晰可見3個核層。由內向外依次為神經節細胞層(GCL)，內核層(INL)以及外核層(ONL)。神經節細胞呈單層排列，細胞大小不一，呈圓形或橢圓形，INL及ONL細胞呈多層分布，內叢狀層(IPL)位于GCL與INL之間，外叢狀層(OPL)位于INL與ONL之間。NMDA組以GCL和IPL損傷最為明顯，神經節細胞減少，胞內空泡樣變性，核固縮濃染，IPL變薄。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)均能抑制NMDA所致神經節細胞的凋亡和IPL的變薄。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網膜無影響(Fig 1)。

3.2 視網膜NMDAR2A的表達 Western blot檢測結果顯示，正常對照組視網膜組織NMDAR2A蛋白表達較低。玻璃體內注射NMDA后，NMDAR2A的蛋白表達明顯增高(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200 和 400 mg·kg－1)明 顯 降 低 NMDA 所 致NMDAR2A的蛋白表達增多(P＜0.01)，并且NMDA+LBP 200和400 mg·kg－1組使 NMDAR2A的表達基本降到正常水平。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網膜NMDAR2A的蛋白表達無影響(Fig 2)。

Fig 2 Effect of LBP on expression of NMDAR2A in NMDA treated rats

3.3 視網膜eNOS和iNOS的表達 Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，NMDA組eNOS的表達明顯降低(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)可明顯抑制NMDA致eNOS表達的減少(P＜0.01)。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網膜 eNOS蛋白表達無影響(Fig 3B)。正常對照組視網膜組織中iNOS幾乎不表達。玻璃體內注射NMDA后，視網膜iNOS蛋白表達明顯增高(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)可明顯抑制NMDA致iNOS表達的增多(P＜0.01)。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網膜iNOS蛋白表達無誘導作用(Fig 3C)。

4 討論

本實驗研究了枸杞多糖對NMDA致大鼠視網膜損傷的保護作用及其機制。研究結果顯示，大鼠眼玻璃體內注射NMDA后，視網膜的厚度變薄，細胞數量減少，細胞層次減少，而其中尤以神經節細胞層(GCL)和內叢狀層(IPL)損傷最為明顯，神經節細胞明顯減少，胞內空泡樣變性，核固縮濃染，IPL明顯變薄，這與Mori等研究報道一致［5］。枸杞多糖可以減輕視網膜病理損傷，以200、400 mg·kg－1給藥最為明顯。提示，枸杞多糖對NMDA誘導的大鼠視網膜損傷有保護作用。

Fig 3 Effect of LBP on expression of eNOS and iNOS in NMDA treated rats

興奮性氨基酸對視網膜內層細胞具有毒性作用。大量文獻報道，NMDA激動其受體介導的興奮性毒性與視網膜缺血和青光眼等多種眼部疾病有關［6－7］。NMDA 受體至少有五個亞基:NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D。其中NMDAR1是NMDA受體一個基本亞基，沒有它受體將沒有功能。NMDAR2A～D亞基可能是調節亞基［8］。NMDAR1在視網膜的興奮性毒性損傷中不發揮作用，而NMDAR2A與氨基酸興奮性毒性損傷機制有關［9］。本實驗研究結果顯示，NMDA可誘導大鼠視網膜組織NMDAR2A蛋白表達增加，這與Matteucci等［10］研究報道相一致。枸杞多糖干預后可使大鼠視網膜組織NMDAR2A表達降低，提示，枸杞多糖可抑制大鼠視網膜組織中NMDAR2A表達的上調。

越來越多的證據表明，一氧化氮在視網膜的生理性修復及病理過程中發揮重要作用［11］。一氧化氮由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成。NOS包括:神經型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)3種。nNOS和eNOS為結構型，在正常視網膜細胞中表達，催化生成生理量的一氧化氮，對視網膜產生保護作用，在視網膜損傷時，表達下降。iNOS為誘導型，正常情況下不表達，在視網膜受各種病理損傷性刺激后大量表達，導致大量具有自由基毒性作用一氧化氮過量的生成，對視網膜產生損傷作用［12］。NMDA受體激活后，可開放電壓門控性鈣通道引起鈣離子內流，激活鈣離子敏感的酶，其中包括iNOS表達的增加。同時鈣離子升高誘導產生大量超氧陰離子并與一氧化氮結合，生成過氧亞硝酸基，誘導神經節細胞凋亡［13］。本實驗研究發現，NMDA玻璃體注射的大鼠視網膜組織中eNOS蛋白表達下降，iNOS蛋白表達明顯增加，這與Nakamichi等研究報道一致［14］。不同劑量枸杞多糖給藥后，尤其高劑量枸杞多糖可以有效的逆轉由NMDA誘導損傷的大鼠視網膜組織中eNOS表達下調和iNOS表達的上升。提示，枸杞多糖對由NMDA誘導的大鼠視網膜損傷保護作用的機制與抑制eNOS/iNOS異常表達有關。

綜上所述，枸杞多糖對NMDA致大鼠視網膜損傷具有保護作用，其機制與調控視網膜NMDAR2A表達以及eNOS/iNOS水平有關。由于視網膜病變存在多種發生機制［15］，枸杞多糖對視網膜病變的保護是否通過其他作用靶點，尚需進一步研究。

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