5-LO表達對鋁鹽致海馬神經元損傷的影響

王健峰，楊俊卿，黃 硯，謝靈瑤，郭遠新，雷文娟

(重慶醫科大學藥理學教研室，重慶 400016)

5-LO(5-lipoxygenase，5-LO)是機體內催化花生四烯酸(AA)生成白三烯(LTs)的關鍵酶，白三烯作為重要的炎癥介質，參與了各種炎癥反應的病理生理過程。5-LO在中樞神經系統廣泛表達，尤其是在小腦和海馬中表達較為明顯，并與腦損傷和神經元退行性疾病如阿爾采末病等密切相關。我們前期研究也發現_，側腦室注射給鋁和慢性灌胃給鋁神經元5-LO mRNA和蛋白表達增加，給予5-LO抑制劑咖啡酸對鋁鹽致神經元損傷具有保護作用［1－3］。為了進一步研究5-LO表達在神經元損傷中的意義，我們將5-LO過表達重組體腺病毒(Ad5-LO)及5-LO RNAi重組體腺病毒(Ad5-LO-RNAi)轉染原代培養的海馬神經元，觀察5-LO的表達對鋁鹽負荷致海馬神經元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h的SD大鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供［動物許可證號:SCXK(渝)20070001］。293細胞株由重慶醫科大學檢驗系提供。5-LO過表達重組體腺病毒及5-LO RNAi重組體腺病毒均由美國芝加哥大學骨科腫瘤分子生物學實驗室饋贈。DMEM/F12、B27，均購于美國 Gibco公司;特級胎牛血清，購于天津灝陽公司;青霉素(80萬U)、鏈霉素(100萬U)，均購于華北制藥股份有限公司;多聚-L-賴氨酸、噻唑藍(MTT)試劑盒、1×Tris-甘氨酸緩沖液、電轉移緩沖液，均購于美國Sigma公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所;RT-PCR試劑盒，購于TaKaRa公司;PCR MIX染料，購于廣東東盛科技公司;RIPA細胞裂解液，購于北京百泰克生物技術有限公司;5-LO一抗(羊多抗5-LO)，購于美國Santa Cruz公司;5-LO二抗、SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白定量試劑盒，均購于北京博奧森公司;ECL化學發光試劑盒，購于美國Pierce公司;六水三氯化鋁(AlCl3·6H2O)、氯化鈉(NaCl)均為國產分析純;PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經元原代培養及分組［2，10］取新生24 h內的SD大鼠，以體積分數為0.75的乙醇全身消毒后，斷頭取腦，分離雙側海馬。海馬組織于冰浴的D-Hanks液中，剪碎約0.1 mm3。加入適量的質量濃度為1.25 g·L－1的胰酶，于37℃的 CO2培養箱中消化20～30 min，每10 min輕輕搖勻1次。加入含體積分數為0.20胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化。吹打成細胞懸液后，200目細胞篩過濾。取細胞懸液800 r·min－1離心8 min，去上清，重復離心2次。用含體積分數為0.20胎牛血清的DMEM/F12培養基調整細胞密度至1×109細胞·L－1，分別接種于已用 0.05 g·L－1多聚-L-賴氨酸預處理的細胞培養板或細胞培養瓶中，置于37℃的CO2培養箱培養。24 h后，換成含體積分數為0.02的B27的DMEM/F12培養基繼續培養。每3天半換液1次，至實驗結束。實驗采用培養7 d的神經元。

實驗共分為7組:空白對照組(NaCl 200 μmol·L－1)、空載腺病毒組(MOI=100)、5-LO過表達腺病毒組(MOI=100)、5-LO RNAi腺病毒組(MOI=100)、空載腺病毒(MOI=100)+鋁鹽負荷組(AlCl3200 μmol·L－1)、5-LO 過表達腺病毒(MOI=100)+鋁鹽負荷組(AlCl3200 μmol·L－1)、5-LO RNAi腺病毒(MOI=100)+鋁鹽負荷組 (AlCl3200 μmol·L－1)。

1.2.2 腺病毒的擴增與滴度測定［4］293細胞用含體積分數為0.10胎牛血清的DMEM培養液培養至融合后，加入1.5 μl腺病毒原液，于37℃的CO2培養箱中孵育培養。當出現細胞病理效應時，收集細胞沉淀，加入 0.5 ml完全培養液，于 37℃和－80℃反復凍融4 次。4℃，8 000 r·min－1，離心15 min，收集上清即為腺病毒擴增液。將細胞密度為108cells·L－1的293細胞接種于96孔板內，每孔90 μl，培養24 h。每12個孔為1組，第1孔加入10 μl待測腺病毒液，混勻后依次取10 μl做10∶1倍比稀釋并加入后1孔，棄去倒數第2孔中吸出的10 μl培養液，最后1孔做陰性對照。培養24 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞數量，未觀察到熒光的細胞(上1孔熒光細胞數≥5)孔為計數孔(計為1U)。病毒滴度=1U×計數孔相對于第1孔的稀釋倍數/第1孔加入病毒的體積，即1×10(n+1)kU·L－1，n= 計數孔。

1.2.3 海馬神經元病理形態學觀察 24孔培養板內接種于蓋玻片上的培養7 d的海馬神經元，藥物處理及分組同“1.2”方法。繼續培養24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態結構變化，攝片。

1.2.4 MTT法測定細胞存活率 96孔培養板內培養7 d的海馬神經元，藥物處理及分組同“1.2”方法。繼續培養24 h后，每孔加入 MTT溶液20 μl(終濃度為5 g·L－1)，37℃的CO2培養箱孵育4 h后吸去培養液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，避光震搖以溶解結晶。酶標儀于570 nm處測定每孔OD值。

1.2.5 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定 24孔培養板培養7 d的海馬神經元，如上分組處理。繼續培養24 h后，按照LDH檢測試劑盒說明書于440 nm處測定LDH的OD值。蛋白定量采用考馬斯亮藍法進行測定，具體操作按照說明書進行。

1.2.6 測定SOD活性和MDA含量 24孔培養板培養7 d的海馬神經元，如上分組處理。繼續培養24 h后，按照SOD活性檢測試劑盒說明書及MDA含量檢測試劑盒說明書操作，分別于550 nm和532 nm處分別檢測SOD和MDA的OD值。蛋白定量采用考馬斯亮藍法進行測定，具體操作按照說明書進行。

1.2.7 RT-PCR檢測海馬神經元5-LO mRNA的表達 培養7 d的海馬神經元，如上分組處理。繼續培養24 h。按說明書提取總RNA，測定濃度并分裝。逆轉錄合成cDNA后進行PCR擴增。PCR所用引物為:5-LO(5'-TGTACCCAGAGGAGCAT-3'，5'-ACGGCAAAGCCTTAGAT-3'，PCR產物長度為 177 bp);β-actin(5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，5'-GTGCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3'，PCR 產 物 長度為358 bp)。反應條件為94.0℃ 3 min，94.0℃ 30 s，55.0℃ 30 s，72.0℃ 40 s，72.0℃ 5 min，共計 35循環。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad成像分析系統進行圖像分析。

1.2.8 Western blot檢測海馬神經元5-LO蛋白的表達 培養7 d的海馬神經元，如上分組處理。繼續培養24 h。用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。等量蛋白上樣進行SDSPAGE電泳。常規轉膜。50 g·L－1的脫脂奶粉封閉1 h;加一抗，37℃振搖孵育2 h;充分洗膜后，加二抗，37℃振搖孵育2 h。TBST洗3 min×3次。ECL化學發光。

Fig 1 Effect of 5-LO expression on pathomorphology in primarily cultured rat hippocampal neurons(Fluorescence microscope，×200)

2 結果

2.1 腺病毒滴度 測得空載腺病毒滴度=109kU·L－1;5-LO過表達腺病毒滴度=109kU·L－1;5-LO RNAi腺病毒滴度=109U·L－1。根據公式計算轉染神經元需要加入的病毒量:MOI=病毒滴度×V(需加入的病毒液體積)/神經元細胞數，即當MOI=100 時，V=100 μl。

2.2 海馬神經元病理形態 空載腺病毒組、5-LO過表達腺病毒組和5-LO RNAi腺病毒組海馬神經元胞體飽滿，突觸結構完整清晰;空載腺病毒+鋁鹽負荷組神經元數目明顯減少，胞體萎縮，突觸變短，可見細胞碎片。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組神經元數目減少更為明顯，胞體萎縮，突起減少變短，細胞碎片明顯增多;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負荷組神經元數目明顯增多，細胞形態飽滿，突起結構完整清晰并部分連接成網(Fig 1)。

Tab 1 Effect of 5-LO expression on MTT value in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

Tab 1 Effect of 5-LO expression on MTT value in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs Adenovirus-treated group;#P＜0.05 vs Adenovirus+Aluminum-treated group

Group OD Control 0.764 ±0.071 Adenovirus-treated 0.779 ±0.077 Ad5-LO-treated 0.760 ±0.056 Ad5-LO-RNAi-treated 0.740 ±0.122 Adenovirus+Aluminum-treated 0.508 ±0.063＊＊Ad5-LO+Aluminum-treated 0.420 ±0.073#Ad5-LO-RNAi+Aluminum-treated 0.581 ±0.042#

2.3 海馬神經元存活率 由Tab 1所示，與空白對照組比較，空載腺病毒組、5-LO過表達腺病毒組及5-LO RNAi腺病毒組MTT值無明顯差異。與空載腺病毒組比較，空載腺病毒+鋁鹽負荷組MTT值明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組MTT值降低更明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負荷組MTT值明顯升高，差異有顯著性(Tab 1)。

2.4 海馬神經元LDH漏出率 由Tab 2所示，與空白對照組比較，空載腺病毒組、5-LO過表達腺病毒組及5-LO RNAi腺病毒組LDH漏出率無明顯差異。與空載腺病毒組比較，空載腺病毒+鋁鹽負荷組LDH漏出率明顯增加，差異有顯著性(P＜0.01)。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組LDH漏出率增加更明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負荷組LDH漏出率明顯降低，差異有顯著性(Tab 2)。

Tab 2 Effect of 5-LO expression on LDH leakage in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

Tab 2 Effect of 5-LO expression on LDH leakage in primarily cultured rat hippocampal neurons(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs Adenovirus-treated group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Adenovirus+Aluminum-treated group.

Group Leakage of LDH/%Control 17.93 ±2.98 Adenovirus-treated 18.03 ±3.81 Ad5-LO-treated 18.65 ±4.11 Ad5-LO-RNAi-treated 19.02 ±3.06 Adenovirus+Aluminum-treated 39.68 ±4.82＊＊Ad5-LO+Aluminum-treated 48.07 ±5.17#Ad5-LO-RNAi+Aluminum-treated 23.73 ±5.61##

2.5 海馬神經元SOD活性和MDA含量 由Tab 3所示，與空白對照組比較，空載腺病毒組、5-LO過表達腺病毒組及5-LO RNAi腺病毒組SOD活性和MDA含量無明顯變化。與空載腺病毒組比較，空載腺病毒+鋁鹽負荷組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組SOD活性降低和MDA含量增加更明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負荷組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低(Tab 3)。

Tab 3 Effect of 5-LO expression on SOD activity and MDA content in primarily cultured rat hippocampal neurons( ± s，n=6)

Tab 3 Effect of 5-LO expression on SOD activity and MDA content in primarily cultured rat hippocampal neurons( ± s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs Adenovirus-treated group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Adenovirus+Aluminum-treated group

Group SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Control 86.28 ±5.90 2.25 ±0.55 Adenovirus-treated 83.83 ±6.00 2.20 ±0.45 Ad5-LO-treated 82.53 ±3.51 2.25 ±0.39 Ad5-LO-RNAi-treated 83.75 ±4.91 2.74 ±0.29 Adenovirus+Aluminum-treated 46.38 ±4.04＊＊ 4.20 ±0.59＊＊Ad5-LO+Aluminum-treated 40.48 ±2.28# 5.10 ±0.33#Ad5-LO-RNAi+Aluminum-treated 71.73 ±3.77## 3.22 ±0.28#

2.6 海馬神經元5-LO mRNA的表達 結果顯示，空載腺病毒組與空白對照組無明顯差異。與空載腺病毒組比較，5-LO過表達腺病毒組和空載腺病毒+鋁鹽負荷組5-LO mRNA表達均明顯升高;5-LO RNAi腺病毒組5-LO mRNA表達明顯降低，差異有顯著性。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組5-LO mRNA表達升高更為明顯;5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負荷組5-LO mRNA表達明顯降低，差異有顯著性(Fig 2～5)。

Fig 2 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 3 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 4 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 5 Change of 5-LO mRNA expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

2.7 海馬神經元5-LO蛋白的表達 結果顯示，空載腺病毒組與空白對照組5-LO蛋白表達無明顯差異。與空載腺病毒組比較，5-LO過表達腺病毒組和空載腺病毒+鋁鹽負荷組5-LO蛋白表達均明顯升高;5-LO RNAi腺病毒組5-LO蛋白表達明顯降低，差異有顯著性。與與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過

表達+鋁鹽負荷組5-LO蛋白表達升高更為明顯;5-LO RNAi+鋁鹽負荷組5-LO蛋白表達明顯降低，差異有顯著性(Fig 6～9)。

Fig 6 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 7 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

Fig 8 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

3 討論

海馬是中樞神經系統的重要組成部分，主要參與學習記憶、情緒等功能的調節，且容易受到外傷、缺血、缺氧等疾病因素的影響。原代培養海馬神經元具有影響因素單一、機體干擾因素少、結果易于分析等優點，是從細胞和分子水平研究海馬神經元損傷的理想模型。

Fig 9 Change of 5-LO protein expression in primarily cultured rat hippocampal neurons

本實驗用含2%B27的無血清DMEM/F12培養基進行原代培養，神經元生長良好。培養至d 7，將重組體腺病毒轉染原代培養的海馬神經元。結果發現，單純的5-LO過表達并不引起海馬神經元的損傷。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組神經元數目更為減少，MTT值亦明顯降低，LDH漏出率和5-LO mRNA和蛋白表達增多也更為明顯，說明5-LO過表達加鋁鹽負荷加重了鋁鹽負荷對海馬神經元的損傷作用。結果還發現，單純的抑制5-LO表達，對海馬神經元沒有明顯的影響，而5-LO RNA干涉能明顯降低鋁鹽負荷所導致的神經元損傷。與我們的研究結果類似，Jones等［5］也發現單純的5-LO過表達不引起肺動脈高壓的發生，而5-LO過表達的同時給予野百合堿處理卻能促進野百合堿所導致的肺動脈高壓的形成，給予5-LO抑制劑MK-886后能夠明顯改善野百合堿所致的肺動脈高壓現象。因此，5-LO的過表達能夠增強海馬神經元對鋁的易感性，加重損傷作用，而抑制5-LO的表達能夠抑制該現象的發生。

已有研究發現，鋁能夠增強活性氧類(ROS)自由基的生成和脂質過氧化過程，大量自由基的產生通過激活5-LO，最終造成神經元的損傷［6-9］。我們實驗結果還發現單純5-LO過表達組SOD活性和MDA含量無明顯變化。單純鋁鹽負荷組SOD活性降低，MDA含量顯增多。與空載腺病毒+鋁鹽負荷組比較，5-LO過表達腺病毒+鋁鹽負荷組SOD活性降低更為明顯，MDA含量增多更為明顯;而5-LO RNAi腺病毒+鋁鹽負荷組SOD活性升高，MDA含量減少。研究結果進一步證明鋁鹽負荷所致神經元損傷機制與5-LO介導的炎癥反應和氧化應激反應密切相關。

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