綠原酸對高脂乳誘導小鼠胰島素抵抗形成的影響

梁秀慈，孟 文，鐘英麗，黃 林，何莞嫣，王 征

(湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指外周組織及其靶器官對胰島素(Insulin，INS)的敏感性及反應性降低，即正常劑量的INS產生低于正常生物學效應的一種狀態。胰島素抵抗不僅是一種代謝疾病，而且是高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、冠心病等代謝疾病之間的紐帶，更是Ⅱ型糖尿病的發病基礎和伴隨性狀［1］。近幾年胰島素抵抗患者人數成指數倍增加，如何防治胰島素抵抗具有重要的意義。

綠原酸是一類多酚類化合物，日常飲料如綠茶、苦丁、咖啡及常見的中草藥如金銀花、杜仲中含量都非常豐富［2］，作為植物的次生代謝物，具有抗氧化、抗菌消炎、降糖、降血脂等多種功效［3－4］。近幾年有研究表明［5－7］，含有綠原酸的天然產物或植物提取物有減緩Ⅱ型糖尿病形成的作用。本實驗在同時灌胃綠原酸和高乳脂劑的情況下，通過檢測胰島素敏感指數、血脂、相關基因的表達以及靶器官組織細胞形態變化等方面來探討綠原酸是否能抑制或緩解小鼠產生胰島素抵抗，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 含量98%綠原酸(長沙湘資生物科技有限公司)，小鼠胰島素ELISA試劑盒(美國RD進口分裝)，甲基硫氧嘧啶、DEPC(sigma)，反轉錄試劑盒(Fermentas公司)，TRizol(Invitrogen公司)，丙二醇、膽固醇、谷氨酸鈉(上海國藥)，引物(華大基因有限公司)，TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

1.2 主要儀器 Multiskan MK3全自動酶標儀［賽默飛世爾(上海)儀器有限公司］，羅康全優越型血糖儀及試紙(德國羅氏診斷公司)，BS-200全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)，PCR儀(Eppendorf)

1.3 動物分組及給藥 SPF級昆明小鼠，♀，30只，體質量(30.56±1.40)g，由湖南斯萊克景達公司提供(動物許可證:HNASLKJ20100773)。適應性飼養1周后，小鼠隨機分組:①對照組(Control)每天灌胃0.6 ml蒸餾水和10 ml·kg－1的生理鹽水;②綠原酸干預組(CGA+HFE)0.6 ml高脂乳劑和20 mg·kg－1的綠原酸;③高乳脂組(HFE)每天灌胃0.6 ml高脂乳劑和10 ml·kg－1的生理鹽水。自由進食，每天監測飲水飲食，每周測小鼠體重。根據文獻［8］中報道進行改進，高脂乳劑配方:豬油20 g，丙二醇30 ml，甲基硫氧嘧啶2 g，膽固醇5 g，果糖10 g，谷氨酸鈉1 g，蔗糖5 g，蛋白質2 g，吐溫80 20 ml，定容至200 ml。

1.4 口服糖耐量實驗 于實驗第28天，禁食12 h，尾部采血測空腹血糖，給予Control組和HFE組灌胃生理鹽水及CGA+HFE組灌胃20 mg·kg－1綠原酸并每組小鼠灌胃2.5 g·kg－1的葡萄糖，測定15、30、60、120 min 的血糖值。

1.5 動物的處死 于實驗第30天，禁食12 h，給予60 mg·kg－1劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，拔眼球取血，獲得血清。解剖，取肝臟、胰腺、骨骼肌、腎臟用于生化試驗和生理切片。

1.6 血清胰島素敏感指數及胰島素抵抗指數 用小鼠Elisa試劑盒檢測血清中的胰島素含量。胰島素敏感指數ISI=ln［1/(FBG×FINS)］及胰島抵抗指數HOMA-IR=(FBG ×FINS)/22.5

1.7 血脂含量的測定 用TC、TG、HDL-C和LDLC測定試劑盒在BS-200全自動生化分析儀上分別測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

1.8 生理切片及免疫組化 用10%的甲醛將腎臟和胰腺固定后，包裝成石蠟切片。腎臟和胰腺的石蠟切片用HE染色法進行染色。胰腺的石蠟切片經抗原修復后進行免疫組化實驗。

1.9 RT-PCR 采用Trizol法提取肝臟和骨骼肌的mRNA，用第一鏈合成試劑盒反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板擴增合成目的片段。G-6-Pase的上游引物:CACCTTGACACTACACCCTT，下 游 引物:GCATGGCGGTTGACTTTA，產物片斷大小 361bp;GLUT4的上游引物:ACTGGCACTTCCACTGAAC，下游引物:TGCTCCCTATCCGTTCTT，產物片斷大小384bp;β-actin的上游引物:GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT，下游引物:TGATCCACATCTGCTGGAAG，產物片斷大小295bp。

1.10 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，實驗結果以±s表示，組間均數用T檢驗比較。

2 結果

2.1 體重變化 分組后，第3周起，3組小鼠體重開始有差異;實驗結束時，CGA+HFE組體重最輕，但3組之間的體重差別無統計學意義。

2.2 綠原酸對口服糖耐量的影響 CGA+HFE組空腹血糖值明顯低于Control組(P＜0.05)和模型組(P＜0.01);灌糖2 h后，CGA+HFE組血糖值明顯低于HFE組(P＜0.05)。見Tab 1。

2.3 綠原酸對胰島素敏感指數的影響 HFE組的FINS明顯高于Control組 (P＜0.05)，也高于CGA+HFE組，但兩者差異無顯著性。HFE組的ISI明顯低于Control組 (P＜0.01)和CGA+HFE組 (P＜0.01)。CGA+HFE組的 HOMA-IR明顯低于HFE組(P＜0.01)，同時也低于Control組。見Tab 2。

Tab 1Comparison of OGTT of mouse in three groups(±s，n=10)

Tab 1Comparison of OGTT of mouse in three groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;ΔP＜0.05 vs HFE group

Group OGTT/mmol·L －1 0 min 15 min 30 min 1 h 2 h Control 3.90 ±0.61 9.40 ±1.11 8.90 ±1.19 6.30 ±1.19 4.40 ±0.65 CGA+HFE 3.00 ±0.34＊＊Δ 10.03 ±2.19 9.166 ±3.66 7.80 ±1.09* 4.73 ±0.45Δ HFE 4.27 ±0.78 9.02 ±1.35 10.44 ±1.41 8.06 ±1.22* 5.80 ±0.36＊＊

Tab 2 Level comparison of FINS，ISI and HOMA-IR in blood serum of mouse in three groups(±s，n=10)

Tab 2 Level comparison of FINS，ISI and HOMA-IR in blood serum of mouse in three groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;ΔΔP＜0.01 vs HFE group

Group FINS/μg·L －1ISI HOMA-IR Control 16.12 ±1.44 －4.09 ±0.17 2.71 ±0.45 CGA+HFE 17.48 ±3.27 －3.95 ±0.09ΔΔ 2.32 ±0.22ΔΔ HFE 19.33 ±2.18* －4.40 ±0.25＊＊ 3.74 ±1.07*

2.4 空腹血清血脂水平 HFE組血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量高于Control組，其中后3項指標差別明顯(P＜0.05);CGA+HFE組相對Control組而言，TC、LDL-C雖有所升高，但差別無統計學意義。CGA+HFE組與HFE組比較，TG和LDLC明顯降低(P＜0.05)，TC也一定程度降低。見Tab 3。

Tab 3 Content comparison of TG，TC，HDL-C，LDL-C in blood serum of mouse in three groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;ΔP＜0.05 vs HFE group

2.5 肝臟G-6-Pase mRNA表達的改變 HFE組肝臟G-6-Pase mRNA表達量較Control組明顯升高(P＜0.05);CGA+HFE組與HFE組比較，肝臟G-6-Pase mRNA表達量明顯下調(P＜0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Comparison of G-6-Pase mRNA expressions in liver in three groups

2.6 骨骼肌GLUT4 mRNA表達的改變 HFE組骨骼肌GLUT4 mRNA表達量較Control組明顯下降(P＜0.01);CGA+HFE組與HFE組比較，骨骼肌GLUT4 mRNA的表達量明顯上調 (P＜0.01)。見Fig 2。

Fig 2 Comparison of GLUT4 RNA expressions in skeletal muscle in three groups

2.7 腎臟HE染色 Control組的腎小球、腎小管及間質都正常，見Fig 3A;CGA+HFE組腎小球腎小管無異常改變，見Fig 3B;HFE組腎小球肥大，腎小球彌漫分布玻璃樣物質，腎小球基質膜增厚，腎小管上皮細胞出現空泡樣變性，見Fig 3C。

Fig 3 Comparison of pathological changes of glomerulus in three groups(×400)

2.8 胰腺HE染色及β細胞免疫組化觀察 Control組和CGA+HFE組的胰腺胰島細胞排列整齊，細胞核清晰;HFE組胰腺胰島細胞細胞核不清晰，核質顏色變淡。見Fig 4。通過體視學圖像分析對胰腺β細胞免疫組化進行分析得出，HFE組的平均灰度值明顯低于 Control組的平均灰度值 (P＜0.05)。而CGA+HFE組的平均灰度值組處于HFE組和Control組的平均灰度值之間，但均差異無顯著性(P＞0.05)見Fig 5。

Fig 4 Comparison of pathological changes of pancreas in three groups(×400)

Fig 5 Comparison of immunostaining of insulin on β-cells in pancreas in three groups(× 400)

3 討論

胰島素抵抗的形成機制復雜，它的靶器官包括肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、胰腺、脂肪組織等。研究發現［9－10］，長期高脂飲食會導致胰島素抵抗。肝臟G-6-Pase mRNA水平的異常升高和骨骼肌GLUT4 mRNA含量的降低是胰島素抵抗的重要標志［11－13］。并伴隨著不同器官的損傷，例如胰島β細胞均存在INS信號轉導障礙［14］和腎小球肥大、彌漫性腎小球硬化、腎小管和間質損傷、血管損害［15－16］等。本研究中，只灌胃高乳脂的實驗小鼠與正常對照組比較，ISI指數降低，HOMA-IR、血糖血脂均升高明顯，降糖能力減弱。表明小鼠已出現了胰島素抵抗的基本性狀;而綠原酸干預組小鼠與之比較，各項指標差別明顯。說明即使灌胃了高乳脂劑，但在綠原酸的干預下，小鼠的降糖能力得到改善、ISI指數明顯上升、HOMA-IR明顯下降、血清中的TC，TG，LDL-C水平降低、肝臟中的G-6-Pase mRNA表達量下調、骨骼肌中的GLUT4 mRNA表達量上升，而且腎臟和胰腺都未觀察到有損傷情況。結果表明綠原酸可以降低血脂，減緩糖異生;增加葡萄糖在肌肉組織中的轉運和利用率，有效調節糖代謝過程;增加胰島素敏感性，減緩胰島素抵抗發生進程。

綜上所述，本實驗從分子水平及細胞水平探討了綠原酸對小鼠發生胰島素抵抗的影響和作用機制，證明綠原酸能減緩小鼠胰島素抵抗發生進程。自然界中，綠原酸分布廣泛，含量及其異構體豐富［17］，具有潛在的預防與胰島素抵抗相關疾病的功能。我們的研究結果為開發具有降糖作用，改善胰島素抵抗的功能性食品和新藥設計提供了有意義的理論參考。

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