Urantide對大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細胞凋亡的作用及機制研究

張駿艷，姚 華，李 晟，孫璇君，陳志武

1.抗炎免疫藥理學省部共建教育部重點實驗室，國家中醫藥管理局中藥藥理三級實驗室，安徽醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，安徽 合肥 230032;2.安徽醫科大學生命科學院生物學教研室，安徽合肥 230032)

近年來，動脈搭橋術、溶栓療法、經皮腔內冠脈血管成形術、體外循環心臟外科手術和心肺腦復蘇術等手段的建立和推廣應用，使得缺血心臟能在短時間內重新獲得血液灌注并恢復氧供應。但臨床研究發現這種在心肌缺血基礎上恢復血流后，組織損傷加重、甚至發生不可逆性損傷的現象稱為心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。活性氧自由基在缺血和再灌注過程中產生增加并在該病理過程中發揮了重要的作用［1］。而且再灌注可加速由于心肌缺血促發的心肌細胞凋亡過程，證實細胞凋亡也參與了缺血/再灌注的病理損傷過程［2］。

Urantide是在UrotensinⅡ基礎上衍生的肽類UT受體拮抗劑，與 hUⅡ結構相似，為環11肽［3］。Urantide與重組人、猴、貓、鼠等多種動物的UT受體均具有相當高的親和力。本課題組前期研究表明Urantide對心肌缺血/再灌注大鼠的心臟具有保護作用，其作用機制可能與改善低灌流、清除氧自由基及抗脂質過氧化、增加NOS活性、促進NO合成及抑制鈣超載有關［4］。最近研究表明［5］，urantide 預處理減輕心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的作用還與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)和PKC信號通路有關。

本文旨在整體動物模型基礎上研究PI3K/Akt信號通路和PKC信號通路在urantide抗氧化應激反應和抗心肌細胞凋亡中的作用，為urantide用于心肌保護提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 Urantide:吉爾生化(上海)有限公司合成，經HPLC檢測純度≥95%，凍干粉劑，實驗前用生理鹽水稀釋至所需濃度;鹽酸維拉帕米注射液(Ver):上海禾豐制藥有限公司;LY294002:san-ta cruz biotechnology(sc-201426);白屈菜紅堿(Chelerythrine Chloride，CHE):santa cruz biotechnology(sc-3547);伊文思蘭:國藥集團化學試劑有限公司產品;TTC:Sigma公司產品;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建成生物醫學工程研究所。兔抗Bax多克隆抗體及兔抗Bcl-2多克隆抗體均為Santa Cruz產品;免疫組化試劑盒:北京中杉金橋生物技術有限公司產品;TUNEL檢測試劑盒:德國Roche公司產品。

1.2 動物 選用SD大鼠，♂，體質量300～380 g，由安徽醫科大學動物中心提供。合格證號:SCXK(皖)2005－0001號。

1.3 儀器 HX-300動物呼吸機:成都泰盟科技有限公司;BL-420生物機能實驗系統:成都泰盟科技有限公司;TDZ4-WS低速臺式離心機:長沙湘儀離心機儀器有限公司;SpectraMax 190型全波長酶標儀:美國MD公司。

1.4 方法

1.4.1 冠狀動脈左前降支(LAD)結扎/松開致大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型的制備 大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3 ml·kg－1麻醉。大鼠頸前及胸前皮膚常規備皮，仰臥位固定。在環狀軟骨上方0.5 cm處，頸部正中縱形切口顯露氣管，剪一倒“T”型口，置入氣管導管，接小動物呼吸機，呼吸頻率為50～60次/分。四肢皮下插入電極，連接BL-420E生物機能實驗系統，持續記錄心電圖(Ⅱ導聯，ECG)。沿左鎖骨中線心臟搏動處縱向切開皮膚2～3 cm，在第4、5肋間打開胸腔，逐層鈍性分離皮下組織及肌肉，輕輕剪開心包，用自制開胸器擴張切口，使心臟充分暴露。結扎左冠狀動脈前降支，方法為用持針器將6-0真絲帶針線，在動脈圓錐與左心耳之間冠狀靜脈處進針，將結扎線從PE管(直徑2 mm)中間穿出，用PE管一端阻斷冠狀動脈血流，另一端用動脈夾固定。心肌缺血即阻斷血流30 min(缺血表現為其支配的局部心肌組織發紺或蒼白，心電圖ST段明顯抬高或T波高聳，以此作為冠狀動脈結扎成功的標志)，松開動脈夾及PE管再灌注90 min(局部心肌組織轉紅恢復血流，心電圖抬高的ST段下降50%以上)。實驗結束后取血離心，取上清放入－20℃冰箱凍存，嚴格按試劑盒操作測SOD、MDA、NO、NOS等生化指標。

1.4.2 實驗分組及給藥 大鼠隨機分為8組，分別為:①假手術組(sham group):僅穿線，不結扎冠狀動脈;②模型組(model group):結扎左冠狀動脈30 min后，松開結扎線再灌注90 min;③ Urantide 3 μg·kg－1組:于缺血前5 min舌下靜脈1 min內一次推注 urantide 3 μg·kg－1;④ Urantide 10 μg·kg－1組:于缺血前5 min舌下靜脈1 min內一次推注urantide 10 μg·kg－1;⑤ Urantide 30 μg·kg－1組:于缺血前5 min舌下靜脈1 min內一次推注urantide 30 μg·kg－1;⑥ Ver 1.6 mg·kg－1組:于缺血前 5 min 舌下靜脈1 min內一次推注Ver 1.6 mg·kg－1;⑦ Urantide 30 μg·kg－1+CHE(Chelerythrine，PKC 特異性阻斷劑)組:在穿線穩定后，舌下靜脈快速推注CHE 1 mg·kg－1，5 min后舌下靜脈快速推注 urantide 30 μg·kg－1，穩定10 min后再行缺血/再灌注操作;⑧Urantide 30 μg·kg－1+LY294002(PI3K/AKT 信號通路阻斷劑)組:在穿線穩定后，舌下靜脈快速推注LY294002 0.3 mg·kg－1，5 min 后舌下靜脈快速推注 urantide 30 μg·kg－1，穩定 10 min 后再行缺血/再灌注操作。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠血清中SOD、NO活力以及 MDA含量的測定 SOD和NOS采用化學比色法測定，測定波長分別為550 nm和530 nm;MDA采用硫代巴比妥酸鹽法檢測;NO采用硝酸還原酶法測定，各操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.5.2 TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡 各組實驗結束后，取心尖部位心肌組織放入4%甲醛溶液中固定。常規石蠟包埋，切片，用脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞(測法遵照羅氏凋亡檢測試劑盒說明書)。從各組取5張石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)沖洗5 min，3次;蛋白酶K(20 mg·L－1)37℃ 消化 8 min，PBS 沖洗，3 次;3%H2O2室溫下處理5 min以阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，含0.1%TritonX-100的0.1%枸櫞酸溶液以去除細胞膜表面污物(冰上4 min)，PBS沖洗，3次;加50 μl TUNEL反應混合液，包括脫氧核苷酸轉移酶液，37℃ 孵育60 min，PBS沖洗，3次;加POD液37℃孵育30 min，PBS沖洗，二乙胺四乙酸(DAB)顯色。在400倍顯微鏡下，于缺血區邊緣隨機采集5個非重疊視野，檢測100個心肌細胞中TUNEL陽性細胞數，取其平均值。凋亡指數/%=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.5.3 免疫組化檢測大鼠心肌組織中Bcl-2和Bax的表達水平 石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后，蒸餾水沖洗，PBS(pH 7.4)浸泡切片5 min;3%過氧化氫室溫孵育5 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次;在切片上滴加10%正常山羊血清(PBS緩沖液稀釋)，放置在濕盒中，室溫孵育10～15 min，以封閉游離的結合位點，減少非特異性染色;甩去多余山羊血清，勿洗，滴加一抗(抗bcl-2和抗bax的多克隆抗體，用0.01 mol·L－1PBS緩沖液稀釋成1∶100)，4℃孵育過夜;PBS漂洗3次;滴加生物素標記的二抗 (羊抗兔 lgG工作液)，37℃孵育30 min;PBS漂洗3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min;PBS漂洗3次;DAB顯色，在光學顯微鏡下控制顯色時間，鏡下觀察核中出現黃色顆粒及胞質黃染后及時終止;自來水終止顯色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片;陰性對照用PBS代替一抗，按上述步驟同步進行。在高倍鏡下(×400)隨機選取心肌組織連續3個視野，采用形態學圖像分析系統(捷達科技)測量所要觀察區域內免疫陽性細胞單位面積平均光密度。

Tab 1 Changes of segment ST(mv)of ECG by urantide treatment and its modification by CHE and LY294002 in myocardial I/R injury rats(±s，n=10)

Tab 1 Changes of segment ST(mv)of ECG by urantide treatment and its modification by CHE and LY294002 in myocardial I/R injury rats(±s，n=10)

△△ P＜0.01 vs sham;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 30 μg·kg－1urantide

Group Dose/kg－1Ischemia 5 min 30 min Reperfusion 5 min 30 min 60 min Sham － 0.04 ±0.01 0.03 ±0.02 0.03 ±0.01 0.04 ±0.03 0.03 ±0.01 Model － 0.18 ±0.04△△ 0.22 ±0.03△△ 0.20 ±0.05△△ 0.20 ±0.03△△ 0.18 ±0.04△△Urantide 3 μg 0.15 ±0.03 0.20 ±0.03 0.17 ±0.05 0.18 ±0.04 0.15 ±0.03 10 μg 0.10 ±0.02＊＊ 0.18 ±0.03* 0.15 ±0.05 0.16 ±0.04* 0.14 ±0.04 30 μg 0.08 ±0.03＊＊ 0.14 ±0.03＊＊ 0.12 ±0.03＊＊ 0.12 ±0.02＊＊ 0.12 ±0.03＊＊Ver 1.6 mg 0.06 ±0.02＊＊ 0.12 ±0.05＊＊ 0.13 ±0.03＊＊ 0.10 ±0.03＊＊ 0.12 ±0.03＊＊Urantide+CHE 30 μg+1 mg 0.17 ±0.03## 0.21 ±0.06# 0.19 ±0.06## 0.20 ±0.03## 0.18 ±0.03##Urantide+LY294002 30 μg+0.3 mg 0.20 ±0.04## 0.19 ±0.04# 0.21 ±0.05## 0.21 ±0.02## 0.19 ±0.04##

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖結果 結果如Tab 1所示，與假手術組比較，模型組大鼠在心肌缺血及再灌注時ST段抬高明顯，再灌注30 min時尤為明顯;與模型組比較，urantide(10，30 μg·kg－1)能明顯抑制缺血/再灌注大鼠心電圖中ST段的抬高，加快再灌后心臟功能的恢復;陽性藥(Ver)也有類似的作用。而應用了 PKC抑制劑 CHE和 PI3K/Akt抑制劑LY294002能取消urantide改善ECG的作用。

Tab 2 Serum SOD activitiy and MDA content by urantide treatment and its modification by CHE and LY294002 in myocardial I/R injury rats(±s，n=10)

Tab 2 Serum SOD activitiy and MDA content by urantide treatment and its modification by CHE and LY294002 in myocardial I/R injury rats(±s，n=10)

△△P＜0.01 vs sham;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;#P＜0.05 vs urantide(30 μg·kg－1)

Group Dose/kg－1 SOD/U·ml－1 MDA/μmol·L －1 Sham － 180.28 ±5.15 2.28 ±0.96 Model － 145.24 ±19.28△△ 4.94 ±1.55△△Urantide 3μg 156.17 ±13.35* 3.97 ±0.89 10μg 164.65 ±16.17＊＊ 3.59 ±1.15 30μg 171.47 ±13.37＊＊ 3.40 ±1.14*Ver 1.6 mg 175.90 ±5.99＊＊ 3.33 ±0.88*Urantide+CHE 30 μg+1 mg 149.94 ±16.57# 4.42 ±0.90 Urantide+LY294002 30 μg+0.3 mg 148.22 ±19.26#4.04 ±0.95

2.2 各組大鼠血清中SOD活力和MDA含量的測定 結果如Tab 2所示，大鼠心肌缺血/再灌注模型組MDA含量明顯高于假手術組，SOD的活力明顯降低，與假手術組比較差異有顯著性(P＜0.01)。與模型組比較，urantide 3、10、30 μg·kg－1能升高SOD 活性，urantide 30 μg·kg－1能夠明顯減少血清中MDA的生成;而urantide+CHE組與urantide+LY294002組與模型組相比，對SOD活性與MDA含量影響不大。

Tab 3 Serum NO content and NOS activity by urantide treatment and its modification by CHE and LY294002 in myocardial I/R injury rats(±s，n=10)

Tab 3 Serum NO content and NOS activity by urantide treatment and its modification by CHE and LY294002 in myocardial I/R injury rats(±s，n=10)

△△P＜0.01 vs sham;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 vs urantide(30 μg·kg－1)

Group Dose/kg－1 NO/μmol·L －1 NOS/U·ml －1 Sham － 57.43 ±16.83 16.80 ±1.88 Model － 27.13 ±4.86△△ 10.98 ±1.90△△Urantide 3 μg 28.86 ±3.70 11.53 ±3.93*10 μg 32.76 ±4.46 13.36 ±1.68＊＊30 μg 43.58 ±6.63＊＊ 15.40 ±3.38＊＊Ver 1.6 mg 51.52 ±8.76＊＊ 15.59 ±1.58＊＊Urantide+CHE 30 μg+1 mg 28.43 ±6.91## 11.51 ±1.31#Urantide+LY294002 30 μg+0.3 mg 30.30 ±8.80# 11.68 ±1.20#

2.3 各組大鼠血清中NOS活力和NO含量的測定

如Tab 3所示，與假手術組相比，模型組NO含量明顯減少，NOS活力明顯減低;Urantide 30 μg·kg－1及 Ver 1.6 mg·kg－1可增加血清中 NO 含量，urantide 3，10，30 μg·kg－1及 Ver 1.6 mg·kg－1均可提高血清中NOS活性。與模型組比較，在靜脈注射urantide 30 μg·kg－1之前分別給予阻斷劑 CHE 和LY294002均可以使urantide升高NOS活性和NO含量的作用消失。

Fig 1 Representative photomicrographs of in situ detection of TUNEL-positive nuclei by in vivo urantide treatment and its modification by CHE and LY294002(magnification，×400)

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡指數 由Fig 1可見TUNEL法標記的凋亡心肌細胞，凋亡陽性細胞核被染成棕黃色或棕褐色，正常心肌細胞核被蘇木精復染成藍色。由Fig 2可見與假手術組的凋亡指數(9.29±3.44)%相比，模型組凋亡指數明顯升高為(43.54±3.16)%，urantide 3個劑量組均可以不同程度的降低缺血/再灌注大鼠的心肌細胞凋亡指數，在 urantide10 μg·kg－1和 urantide30 μg·kg－1兩個劑量組中，心肌細胞凋亡指數與模型組比較差異有顯著性(P＜0.01)。而urantide+CHE組與urantide+LY294002組的凋亡指數與urantide用藥組相比明顯升高，與模型組相比無統計學意義。

Fig 2 Effect of urantide treatment and its modification by CHEand LY294002 on I/R-induced apoptosis assayed by TUNEL

2.5 各組大鼠心肌組織中Bcl-2和Bax表達水平

免疫組化結果顯示，含Bcl-2或Bax蛋白的細胞漿著染成棕黃色。假手術組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達明顯，而Bax蛋白表達較弱。而在缺血/再灌注組大鼠心肌組織中可見Bcl-2蛋白表達減弱，Bax蛋白表達則有顯著增加;Urantide 3、10、30 μg·kg－1組及陽性藥Ver可不同程度增強Bcl-2蛋白的表達，而減弱Bax的表達;合用1 mg·kg－1CHE或0.3 mg·kg－1LY294002后，urantide對 Bax和 Bcl-2蛋白表達的作用明顯減弱。(見Fig 3，Fig 4)

圖像分析結果顯示，缺血/再灌注組大鼠心肌組織Bcl-2和Bax陽性細胞平均光密度與假手術組比較差異有顯著性(P＜0.01)。Urantide各用藥組及陽性藥Ver能夠增加Bcl-2蛋白表達，減少Bax蛋白表達，使Bcl-2/Bax的比值增大，表明urantide具有抗心肌細胞凋亡的作用。而CHE或LY294002能明顯抑制urantide對Bcl-2表達增強和Bax表達減弱的作用(P＜0.05或P＜0.01)，urantide合用CHE或LY294002組中Bcl-2和Bax的蛋白表達與模型組相比差異無顯著性(P＞0.01)，表明urantide的這種抗凋亡作用可以被蛋白激酶C的阻斷劑CHE和PI3K/AKT信號通路特異性阻斷劑LY294002所阻斷。見Tab 4。

Fig 3 Effect of urantide on the Bax protein immunoreactivity cells in cardiomyocytes of I/R rats(×400，n=4)

Fig 4 Effect of urantide on the Bcl-2 protein immunoreactivity cells in cardiomyocytes of I/R rats(×400，n=4)

3 討論

本實驗采用的在體左冠狀動脈前降支結扎/松開術是經典的心肌缺血/再灌注模型，具有較好的穩定性和重復性。本研究采用的缺血30 min、再灌注90 min模型能較好的誘導心肌缺血/再灌注損傷［6］。

Tab 4 Effect of urantide on the mean optical density of Bcl-2 and Bax of myocardium in myocardial I/R rats( ± s，n=6)

Tab 4 Effect of urantide on the mean optical density of Bcl-2 and Bax of myocardium in myocardial I/R rats( ± s，n=6)

△△P＜0.01 vs sham;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;#P＜0.05，##P＜0.01 vs urantide(30 μg·kg－1)

Group Dose/kg－1Mean optical density Bcl-2 Bax Sham － 0.504 ±0.162 0.233 ±0.077 Model － 0.217 ±0.016△△ 0.728 ±0.199△△Urantide 3 μg 0.287 ±0.044 0.476 ±0.127*10 μg 0.317 ±0.077* 0.409 ±0.060＊＊30 μg 0.370 ±0.135* 0.286 ±0.036＊＊Ver 1.6 mg 0.314 ±0.068* 0.259 ±0.071＊＊Urantide+CHE 30 μg+1 mg 0.232 ±0.059# 0.557 ±0.073##Urantide+LY294002 30 μg+0.3 mg 0.220 ±0.099# 0.554 ±0.185##

心肌細胞凋亡在缺血/再灌注損傷中的作用長期以來受到關注，如何保護心肌細胞，減少凋亡細胞的數量，減小梗死周邊危險區(area of risk)成為心血管領域研究的熱點［7］。已知心肌缺血/再灌注期間的氧化應激能夠誘導心肌細胞凋亡［8］，亦可降低細胞內信號分子一氧化氮的生物利用度，從而抵消了一氧化氮的保護作用［9］。大量氧自由基的產生可導致心肌線粒體功能的不可逆損傷和心肌細胞死亡［10］。

PKC是一組具有單一肽鏈結構的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與細胞信息傳遞、分泌、離子通道調節、細胞增生、分化等一系列與生命現象相關過程。在心肌缺血預適應的觸發階段，腺苷、緩激肽和阿片受體都被激活，盡管這3種受體從不同通路觸發信號轉導，最終均匯聚在PKC通路上。活化的PKC通過磷酸化或耦合其他蛋白使A2b腺苷受體激活，從而進一步活化 PI3K-Akt和 ERK信號通路［11］。

PI3K/Akt信號通路是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，調節著細胞生長、凋亡及細胞一些重要基因的表達。研究發現在某些條件下，激活PI3K/Akt信號通路可有效抑制低氧誘導的心肌細胞凋亡的發生［12］。

本研究表明urantide可以減少心肌缺血/再灌注大鼠體內氧自由基的生成，增加NO含量，提高NOS活性。同時降低心肌細胞凋亡率，下調促凋亡蛋白Bax的表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。而urantide的上述作用均可以被PI3K-Akt信號通路和PKC信號通路阻斷劑所逆轉。提示urantide可以通過激活PKC信號通路和PI3K/Akt信號通路，發揮抗心肌細胞脂質過氧化作用，進一步干預凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白的表達，抑制細胞凋亡的發生，減輕心肌缺血/再灌注損傷。而這兩條信號通路之間的相互作用，以及有無其他信號通路參與其中的作用，有待于進一步研究證實。

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