短鏈脂酰輔酶A脫氫酶與心肌肥大關系的初步探索

羅佳妮，周四桂，陳少銳，陳 溪，鄒 劍，耿 彪，劉培慶

(1.中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東廣州 510006，2.廣東藥學院臨床藥學系，廣東廣州 510006)

心肌肥大是高血壓最常見的并發癥之一，是心臟對血流動力學壓力超負荷、神經體液激素改變以及能量代謝障礙等而發生的一系列病理性適應過程。其主要表現為心肌細胞的肥大和間質成分的改變，心臟順應性和循環泵功能的降低，心臟功能由代償發展為失代償，最終導致嚴重的心律失常和心衰［1］。心肌是耗能最多的組織之一。胚胎時期哺乳動物的心肌處于相對缺氧的環境中，以葡萄糖和丙酮酸為主要能源物質，但在出生后迅速轉化為依賴脂肪酸氧化供能，正常心肌能量的70%都來源于脂肪酸氧化［2］。因此，線粒體脂肪酸β氧化對于維持心肌能量代謝有重要意義。但是，在病理性心肌肥厚過程中，心肌能量來源又轉向葡萄糖和丙酮酸，即“胚胎型轉換”，最終導致心臟能源供應不足［3］。因此，促進脂肪酸β氧化對于預防和逆轉心肌肥大、心力衰竭等病理生理惡性循環有重要意義。

脂酰輔酶A脫氫酶家族中的短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(short-chain acly-coenzyme A dehydrogenase，SCAD)是脂肪酸氧化第一步β氧化的第1個限速步驟酶。SCAD的分子質量為160 000，由4個亞基組成，每個亞基的分子質量為41 000左右。SCAD基因定位于12q22，長度為13 ku，由10個外顯子和1 236個核苷酸組成［4－5］。脂酰輔酶 A脫氫酶家族中，中鏈脂酰輔酶A脫氫酶是肌型肉堿棕櫚酰易位酶的關鍵酶;長鏈脂酰輔酶A脫氫酶的底物長鏈脂肪酸，是過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)的內源性激活配體。脂酰輔酶A脫氫酶家族發揮作用需要黃素腺嘌呤二核苷酸，而SCAD是脂酰輔酶A脫氫酶家族成員中和黃素腺嘌呤二核苷酸綁定最緊密的一員，且SCAD特異性地分解短鏈脂酰輔酶A底物［6］，說明了該家族在心肌肥大和能量代謝中的重要作用。

然而，對于短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(SCAD)的研究以往主要集中在其對神經系統作用的方面［5］，而在心臟中的作用研究較少。本實驗室采用定量蛋白質組學(DIGE)技術比較了16周齡自發性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質組，首次發現SCAD在自發性高血壓大鼠肥大心肌中的表達明顯降低［7］。本研究進一步采用自發性高血壓大鼠和異丙腎上腺素皮下注射大鼠心肌肥大的模型進行驗證，并從細胞水平針對SCAD在心肌肥大中的改變進行初步研究，旨在于探索兩者之間的關系，為尋找心肌肥大新的藥物靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 自發性高血壓大鼠 自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，13周齡，適應性飼養1周后用于實驗。對照組正常采用Wistar大鼠，購于中山大學動物中心。實驗動物在腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg·kg－1)麻醉后，頸總動脈插管采用 BL-420S生物信號記錄儀測量血壓，腹腔靜脈注射KCl(2 mol·L－1)使大鼠心臟驟停在舒張期，迅速打開胸腔取出心臟，用預冷的PBS溶液清洗，吸干水分后用電子天平稱量心臟重量(heart weight，HW)以及左心室重量(left ventricular weight)，計算左心室重指數(LVW/BW)。組織樣本經過液氮速凍過夜后凍存于－80℃冰箱，用于后續試驗。

1.2 乳鼠心肌細胞培養 采用本實驗室已建立的乳鼠心肌細胞改良法分離并培養心細胞［8］，取2～3 d SD乳鼠(中山大學實驗動物中心)用胰蛋白酶(Sigma)冰上消化20 min后，37℃水浴多次消化將乳鼠心臟消化成為單細胞懸液，在差速貼壁分離后，調節細胞密度種于培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，并加入0.1 mmol·L－1Brdu(Sigma)抑制成纖維細胞生長。按照上述方法分離制備的心肌細胞，經alpha-actin抗體的免疫細胞化學染色，純度可達95%以上，符合實驗要求。

1.3 心肌細胞肥大模型的建立 采用苯腎上腺素(phenylephrine，PE，Sigma)建立心肌細胞的肥大模型［9］，濃度為 0.1 μmol·L－1。在無血清培養基(Gibco)培養24 h 后，按照 3、6、12、24、48 h 的時間點進行加藥刺激。

1.4 RT-PCR檢測SCAD的mRNA表達 按照TRIzol(Invitrogen)說明書步驟提取細胞或組織總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的260 nm、280 nm波長下的 OD值，檢測純度并計算出RNA的濃度。參照Takara有限公司RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應，將反應罐放置于PCR儀(Thermo)中進行逆轉錄反應。

1.4.1 Real-Time PCR 擴增 兩步法進行 PCR擴增反應，按照說明書加入熒光染料(TaRaKa)、序列和RT產物后在Real-time PCR儀中進行反應。逆轉錄反應參數:30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min(1個循環)。

1.4.2 RT-PCR擴增產物的引物序列 具體引物序列見Tab 1(上海英濰捷基)。

1.5 Western blot檢測SCAD的蛋白表達 提取各組心肌細胞以及組織總蛋白，BCA試劑盒(Pierce)檢測細胞蛋白含量后調整上樣量，分裝、變性，配置10%SDS分離膠和5%濃縮膠進行電泳，電泳結束后轉移至PVDF膜(Millipore)，室溫封閉1 h后加入一抗(SCAD，1∶1 000，Abcam;α-Tubulin，1∶10 000，Sigma)，過夜。漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h，化學發光試劑增強反應，X線壓片曝光、顯影、定影，結果采用Image J圖像分析系統對條帶進行分析。

1.6 siRNA干擾 siRNA干擾序列購于上海吉瑪制藥技術有限公司，按照其說明書使用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Opti-MEMI(Invitrogen)培養基在心肌細胞上進行實驗。提取蛋白和總RNA進行實驗。具體siRNA序列為:sense:5'CCGCAUCACUGAGAUCUAUTT3'，antisense:5'AUAGAUCUCAGUGAUGCGGTT3'。

Tab 1 Primer sequence of RT-PCR amplification product

2 結果

2.1 自發性高血壓大鼠和異丙腎上腺素皮下注射大鼠體重及左心室重量、左心室重量指數的變化從Tab 2中可以看出，與Wistar大鼠相比，SHR的左心室重量和左心室重量指數都明顯增高;與生理鹽水對照組大鼠比較，異丙腎上腺素皮下注射大鼠模型組的左心室重量和左心室重量指數也明顯增高，說明兩種大鼠模型都發生了明顯的心肌肥大。

Tab 2 Left ventricular mass index in spontaneously hypertensive rats and isoproterenol stimulated model(n=8)

Fig 1 Expression of protein and mRNA in spontaneously hypertensive rats’left ventricular

2.2 自發性高血壓大鼠左心室SCAD蛋白以及mRNA表達的變化 Western blot結果顯示，SHR左心室中目的蛋白SCAD的表達量明顯下降，與實驗室前期蛋白質組學實驗結果中觀察到的現象相符合。在mRNA水平，與正常對照的Wistar大鼠相比較，SHR組中心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)和腦利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)的表達量均明顯上升，有明顯的肥大表現，而SCAD則出現明顯下降，見Fig 1。同時，我們采用了本實驗室中異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)皮下注射制造心肌肥大模型的左心室組織標本，對目的蛋白進行了檢測，從Western blot的結果中可以看出，與正常對照組相比較，模型組中SCAD的表達也明顯下降，與自發性高血壓大鼠的變化趨勢一致，見Fig 1。

2.3 心肌細胞肥大模型中SCAD的蛋白以及mRNA表達的變化 RT-PCR結果顯示，PE刺激12 h后肥大標志基因ANF和BNP整體呈上升趨勢，尤其刺激24 h時ANF和BNP均上升明顯，見Fig 2。PE刺激48 h內，SCAD整體表達均有下降，其中以24 h下降最為明顯。Western blot的結果顯示出與RT-PCR結果相一致的趨勢，SCAD的整體表達均有下降，并且在24h時蛋白表達量下降最為明顯，見Fig 3。

Fig 2 mRNA expression of SCAD in pe-stimulated cardiomyocyte

3.4 siRNA干擾引起心肌細胞的變化 蛋白表達和mRNA表達水平結果均顯示siRNA干擾可以明顯降低心肌細胞中SCAD的表達量，并且在降低了SCAD的表達后，心肌細胞的肥大標記因子ANF、BNP的表達量均有明顯上升，呈現出負性調節的趨勢，說明目的基因SCAD的下降可能參與了心肌肥大的病理過程，見Fig 4。

Fig 3 Protein expression of SCAD in pe-stimulated cardiomyocyte*P＜0.05 vs control

4 討論

高血壓引起的心肌肥大是心臟對急、慢性血流動力學超負荷的一種適應性反應，是心臟為適應長期的壓力或容量負荷而產生的代償性改變。這種病理生理改變以心肌細胞內蛋白質合成增加和細胞體積增大為主要特征。心肌肥厚歷經代償性肥大到失代償性肥大再過渡到心衰的過程，與其中能量代謝由胚胎期低氧耗代謝到出生后脂肪酸的高氧耗代謝，再到病理狀況下低氧耗并最終導致能量饑餓引起心律失常和心衰的過程一致［2－3］。

能量代謝的改變是心肌肥大過程中的重要環節。肥大心肌中脂肪酸利用的減少促進了心肌對葡萄糖氧化的增加，導致肥大心肌能量代謝的“胚胎型再演”，這一轉換使得心肌處于能量饑餓狀態，同時脂肪酸利用減少導致心肌組織總脂質沉積增加，也對其穩定性有一定的影響。研究發現，先天性脂酰輔酶A脫氫酶當中短鏈、中鏈和極長鏈基因突變的新生兒，在應急誘導下會發生低血糖、肝功能不全、心肌病以及猝死等狀況。研究還表明在自發性高血壓心力衰竭小鼠模型中，心肌脂肪酸氧化酶的相關基因轉錄大量減少，PPARα減少到胚胎水平，充分說明了脂肪酸氧化在心肌肥大過程中的重要作用［10］。

Fig 4 Results of downregulating SCAD with siRNA in myocardial cells

本研究著重探索SCAD和心肌肥大之間的關系，實驗結果顯示，在不同的動物模型和細胞肥大模型中，SCAD的蛋白表達均明顯下降，呈現出較好的一致性。在mRNA水平，雖然在PE刺激心肌細胞肥大的時效模型當中，SCAD的整體下降水平不是十分明顯，推測可能是由于翻譯后調節造成，也可能是由于蛋白水平下降明顯，mRNA水平反饋性增加表達量以期蛋白水平的表達能夠均衡。有研究報道［11］，肥大心肌脂肪酸利用相關酶基因轉錄的調控路徑與正常心肌不同。本研究的實驗結果顯示，在SHR和異丙腎上腺素皮下注射兩種整體動物水平，SCAD的mRNA均明顯下降，與SCAD的蛋白表達水平下降一致［13］。SCAD蛋白是其發揮酶活性的功能成分，本實驗結果說明SCAD在心肌肥大中可能具有重要作用。

此外，我們采用RNA干擾技術，觀察到siRNA干擾心肌細胞引起SCAD表達下調的同時，心肌肥大標記因子ANF和BNP均明顯上升，說明SCAD表達量的減少對于心肌肥大過程有重要的影響。同時，有研究發現SCAD表達量的減少會導致其底物丁酰輔酶A的堆積，最終表現為血漿中丁酰肉堿濃度增加以及尿液中乙基丙二酸的含量增加，心肌能量代謝受到影響，出現心肌肥大及心臟功能障礙，為SCAD表達下降和心肌肥大之間的關系提供了進一步的證據［4－5］。

作為脂酰輔酶A脫氫酶家族中的一員，有文獻報道PPARα敲除小鼠心肌中中鏈和長鏈脂肪酸的β-氧化均有降低［12］。脂酰輔酶A脫氫酶家族成員的基因編碼同源性大，但底物的特異性也大［6］，雖然PPARα敲除小鼠心肌中短鏈脂肪酸的β-氧化能力是否有降低尚未見報道，但是文獻證明短鏈脂酰只需肉毒堿轉移酶存在即可進入線粒體進行氧化產能，在心肌肥大的情況下短鏈脂肪酸表達量卻也有降低。PPAR家族在心臟代謝中起著轉錄調控的作用，維持脂質和能量代謝。因此，PPARα對于SCAD可能也具有直接的調控作用，激活PPARα是否能夠增加SCAD的表達，是否能夠逆轉心肌肥大的發生值得進一步研究，SCAD能否成為新的抗心肌肥大藥物靶點，尚需進一步研究證實。

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