大麻素受體在肝星狀細胞活化中的作用及姜黃素干預效應

張自力，張 涉，郭 瑤，王妤清，倪雯霞，張 衍，孔德松，鄭仕中，3

(南京中醫藥大學1.藥學院、2.中藥學一級學科;3.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023)

肝纖維化(hepatic Fibrosis，HF)是繼發于各種形式慢性肝損傷之后組織修復過程中的代償反應，也是慢性肝病發展為肝硬化必經的病理過程。肝纖維化發生時肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)異常活化增殖，并合成與分泌大量的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，最終導致ECM的過度沉積［1－2］。抑制 HSCs增殖、促進其凋亡已然成為當前抗肝纖維化治療的主要策略［3－4］。

內源性大麻素及其受體—大麻素受體1(cannabinoid receptor type 1，CBR1)和大麻素受體2(cannabinoid receptor type 2，CBR2)共同構成了內源性大麻素系統。最近的研究表明內源性大麻素系統參與急性與慢性肝病以及如肝性腦病等引起的并發癥改善與恢復過程，并被認為可能是抗肝纖維化的潛在治療靶點［5－6］。姜黃素(Curcumin)是姜黃屬(Curcuma L.)植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取的一種天然活性成分，用于疾病的治療已經有悠久的歷史。隨著研究的深入，姜黃素治療肝纖維化及其作用機制的研究已成為國內外研究的熱點［7］。那么大麻素受體在姜黃素治療肝纖維化的過程中扮演何種角色，目前尚未見諸報端，我們對其進行了深入的探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SPF級♂ SD大鼠若干只(上海斯萊克公司，SCXK(滬)2011-0005)，姜黃素(SIGMA，No.045K0933，含量≧99.8%)，DMEM 培養基(Gibco)，小牛血清(Gibico)，BCA試劑盒(Pierce)，MTT(Promega)，一抗 MAPK(ERK，p-ERK，JNK，p-JNK，p38，p-p38，Cell Signaling)，CBR1和 CBR2(Bioword)，α1(I)collagen和 Fibronectin(Epitomics)，β-actin(Sigma);FITC 綠色熒光二抗(武漢博士德)。恒溫水浴槽(成都儀器廠，型號HSS-1B)，恒流泵(上海青浦滬西儀器廠，型號HL-2)，全自動高壓滅菌鍋(SANYO，型號 MLS-3020)，萊卡倒置熒光顯微鏡 (德國萊卡公司，型號DM1L)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司，型號Nu-6511)，CO2細胞培養箱(FORMA，型號3111)，純水儀(Spring，型號 S/N020579)，核酸蛋白分析儀(BECKMAN，型號DU640)，電泳槽(Bio-Rad，型號525BR027843)。

1.2 原代大鼠HSCs的分離與培養 按照改良的原代酶消化循環灌流法［8］，Nycodenze密度梯度離心分離提取大鼠原代HSCs，將分離的HSCs進行通過使用DMEM重懸的方法進行簡單的分離、純化，然后采用含20%胎牛血清的低糖DMEM培養基培養所得的原代細胞，傳代4～8代用于實驗。細胞分為實驗組與空白對照組，實驗組加入相應的藥物與刺激物，空白對照則加入DMEM做為陰性對照。實驗過程中對動物的處置經過南京中醫藥大學動物倫理委員會的審批且符合科技部有關善待實驗動物的規定。

1.3 MTT檢測 傳代的HSCs調整細胞懸液濃度后接種于96孔板，每孔 180 μl，1×104個/孔。置37℃、5%CO2恒溫箱培養，待細胞貼壁后除對照組外各組分別加入相應濃度的CBR1與CBR2激動劑與拮抗劑進行干預處理24 h，每組6個復孔。作用時間結束后加入5μg·L－1MTT 溶液 20 μl，繼續培養4 h。移除上清，每孔加入200 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的OD值。評價藥物對細胞的增殖抑制作用。

1.4 Western blot檢測 HSCs經藥物干預處理后，用冰冷的RIPA裂解緩沖液進行細胞裂解，收集細胞裂解物，－80℃儲藏過夜。蛋白混合液融化，于4 ℃、12 000 r·min－1下離心15 min，吸取上清 BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，NC轉膜，非特異性封閉;加入相應一抗，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行雜交。加入ECL發光劑1 ml，曝光、顯影、定影，灰度掃描以定量。

1.5 細胞免疫熒光分析 將HSCs接種多聚賴氨酸包被載玻片，培養細胞至60% ～80%融合率，藥物干預處理24 h后，固定、洗滌、封閉，以兔抗CBR1抗體(1∶200，Bioword)，4℃孵育過夜，空白對照以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)孵育過夜。PBS洗3遍，以羊抗兔(1∶60，武漢博士德)FITC標記的熒光二抗孵育1 h，PBS洗3遍后，進行Hochest染色以標記細胞核。熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2 結果

2.1 CBR1、CBR2受體激動劑與拮抗劑對 HSCs增殖活性的影響 應用MTT實驗探討CBR1激動劑(NADA)與拮抗劑(AM251)，CBR2激動劑(JWH015)與拮抗劑(AM630)的對HSCs增殖的作用效果。結果表明激動CBR1可促進HSCs的增殖，相反拮抗CBR1后則可以抑制HSCs的增殖(P＜0.05)。同時激動CBR2也可抑制HSCs的增殖(P＜0.05)，但抑制CBR2時對HSCs的增殖就沒有明顯的影響(P＞0.05)(Fig 1)。由此可見大麻素受體在HSCs的增殖活化中具有重要作用。

2.2 CBR1受體拮抗劑對HSCs中MAPK信號通路的影響 CBR1與CBR2在HSCs中都有表達，但CBR1在HSCs活化與增殖中起主要調控作用，而CBR2主要分布在免疫細胞中［9］。因此，我們應用CBR1拮抗劑AM251作用于HSCs，觀察其對HSCs中MAPK信號通路的影響。結果表明，CBR1拮抗劑能夠明顯抑制ERK與JNK的磷酸化，并呈劑量依賴性的關系(P＜0.05)，但對P38蛋白的表達沒有什么影響(P＞0.05)。

2.3 姜黃素對CBR1與CBR2蛋白表達的影響我們的前期研究證實姜黃素在體內外對肝纖維化具有明顯的治療效果，可上調HSCs中的PPARγ，抑制TGF-β信號通路［10］。本次實驗我們又通過Western bolt與細胞免疫熒光檢測了姜黃素對HSCs中兩種類型大麻素受體CBR1與CBR2蛋白表達的影響，結果表明姜黃素可抑制HSCs中CBR1的表達(P＜0.05)，但對CBR2的蛋白表達沒有明顯的影響(P＞0.05)。

2.4 姜黃素對CBR1激動劑與拮抗劑的刺激下HSCs表達ECM成分α1(I)collagen和Fibronectin的影響 為進一步研究大麻素受體信號通路在姜黃素抑制HSCs活化增殖中的作用。我們分別加入CBR1的激動劑NADA與拮抗劑AM251，觀察姜黃素對HSCs表達ECM成分α1(I)collagen和Fibronectin的影響。結果表明姜黃素可呈劑量依賴性的抑制CBR1激動劑導致的ECM成分表達的上升，并可協同CBR1拮抗劑抑制HSCs表達ECM成分的作用(P＜0.05，P＜0.01)。

Fig 1 Cell proliferation detection

Fig 2Inhibitory effects of CBR1 antagonist AM251 on MAPK pathway in HSCs(±s)

Fig 3Influence of curcumin on CBR1 and CBR2 protein expression(±s)

Fig 4 Effect of curcumin on protein expression of CBR1 by the fluorescence microscope

3 討論

我國是肝病大國，肝纖維化已經成為影響人們身體健康的重大疾病。多年來學者們一直致力于尋找安全、有效的抗肝纖維化的藥物。已有研究證實姜黃素具有確切的預防和治療纖維化的作用，可明顯減輕多種損傷因子導致的肝臟損傷，并能明顯改善四氯化碳(CCl4)所致大鼠纖維化的病理學改變［7，11］。進一步加強姜黃素對參與HSCs活化信號通路調控及ECM沉積干預機制的研究，對于闡明肝纖維化發病機制及開發新型、有效抗肝纖維化藥物至關重要。

以往對內源性大麻素系統的研究主要集中在神經系統和免疫系統，但近年來研究發現內源性大麻素及其相應的受體在肝纖維化的發生發展中也起一定作用。動物實驗研究發現，CCl4或酒精誘導的肝纖維化動物模型中，給予CBR2受體拮抗劑可以使肝纖維化的發生發展速度加快，纖維化程度明顯加重，而激活CBR2受體可以有效抑制肝纖維化的發生發展［12］。對CBR1受體研究發現，激活CBR1受體可以促進肝纖維化發展，給予CBR1受體拮抗劑(例如:SR141716A)可以減輕肝臟急性損傷時肝組織損傷修復反應，抑制肝纖維化的發展進程，給予CBR1基因敲除小鼠CCl4或酒精誘導肝纖維化，CBR1基因敲除小鼠肝臟纖維化發生發展較正常組小鼠的速度明顯減慢，其纖維化程度也較正常組的減輕［6］。我們的研究發現體外激動或者拮抗HSCs大麻素受體，則同樣能夠獲得與體內實驗相同的結果。這表明大麻素受體信號通路在肝纖維化的發生與發展過程的確實具有重要的作用。

Fig 5 Curcumin inhibited the expression of ECM components in HSCs stimulated by CBR1 agonist NADA(±s)

在肝纖維化發生時大麻素受體可能參與HSCs中的MAPK信號通路的調控［13－14］。在本研究中我們發現 CBR1的拮抗劑 AM251可抑制 HSCs中ERK、JNK的磷酸化水平。應用姜黃素干預HSCs時，會導致CBR1表達降低。進一步應用大麻素受體激動劑與拮抗劑分別進行干預處理并觀察姜黃素對HSCs表達ECM成分的影響，姜黃素不僅能劑量依賴性的抑制CBR1激動劑導致的ECM成分表達的上升，并可協同 CBR1拮抗劑抑制HSCs表達ECM成分的作用。結果表明姜黃素抑制肝星狀細胞活化與增殖的作用部分依賴于對大麻素受體信號通路的干預作用。我們的研究證實了大麻素受體在姜黃素抑制HSCs增殖、活化中的重要作用。本研究為肝纖維化的研究及治療提供了新的思路，豐富了中藥在治療肝纖維化方面的機制研究，對推進中藥治療肝纖維化的研究具有重要意義。但本研究同樣還有很多未解決的問題，比如:姜黃素是通過何種途徑影響大麻素受體表達的?大麻素受體又是怎樣影響ECM合成的等等，還需要進一步的深入研究。

Fig 6 HSCs were treated with DMEM，or，curcumin and/or AM251 at the indicated concentrations for 24 h(±s)

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