釀酒酵母GSH I基因的克隆、表達與結構分析

宋冬梅，朱益波，周麗麗，鄭麗雪，齊 斌，*

(1.吉林農業大學，食品科學與工程學院，吉林長春130118;2.常熟理工學院發酵工程技術研究中心，蘇州食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟215500)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是在γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)的連續催化下合成的含巰基活性三肽，具有解毒、抗氧化和抗衰老等重要的生理功能［1－3］，在食品、醫藥和生物等領域有著廣泛地應用［4－7］。但是我國GSH的生產滿足不了市場的需求。近年來，GSH生產研究的熱點是利用DNA重組技術構建高產GSH的重組菌。Murata等［8］構建了具有較高GSH催化活性的重組 Escherichia coli。沈立新等［9］構建了含 GSH I及GSHⅡ基因的質粒pTrc－gsh，并在E.coli中得到了活性表達。Liao等［10］構建的E.coli GSH I和GSH Ⅱ基因融合表達質粒，提高了胞內GSH含量。這些研究在一定程度上提高了重組菌GSH的產量，但總的來說都不理想。GSH I是GSH合成途徑的關鍵酶和限速酶［11］，構建高GSH I活性的菌株將有助于提高重組菌GSH的產量。本文從實驗室保存的一株高產GSH的Saccharomyces cerevisiae 2－10515出發，采用PCR技術擴增得到GSH I基因，并在E.coli中實現表達，同時利用生物信息學方法對GSH I基因序列和結構進行分析和預測，為進一步提高GSH I表達量和活性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

S.cerevisiae 2－10515、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、質粒pET－28a 本實驗室保藏;DNA限制性內切酶Sac I和HindⅢ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、pMD19－T 載體、DNA Marker、質粒小量提取試劑盒、DNA純化及膠回收試劑盒等 TaKaRa公司;其他試劑 均為國產分析純;YEPD培養基、LB培養基 配方見文獻［12］。

高速臺式離心機Legend Micro 17R Thermo公司;PCR儀、Gel Doc XR、水平電泳系統、垂直電泳系統、凝膠電泳成像儀 Bio－RAD公司;恒溫金屬浴Eppendorf公司;SW－CJ－ZF凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;恒溫培養箱 太倉市華美生化儀器廠;電子天平 Mettler公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 根據Gene bank里已公布的S.cerevisiae S288c的gsh I基因設計引物，分別在上游和下游引物中引入酶切位點Sac I和HindⅢ:

P1(Forward):CACGAGCTCATGGGACTCTTAGCTTT酶切位點Sac I

P2(Reverse):CCCAAGCTTTTAACATTTGCTTTCTA酶切位點HindⅢ

1.2.2 克隆載體的構建 采用周小玲等人［13］的方法提取S.cerevisiae 2－10515的基因組 DNA，以其為模板，P1和P2為引物進行PCR擴增，得到gsh I基因。PCR 反應參數為:95℃ 5min;94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min(30cycles);72℃ 10min。將gsh I連接到克隆載體pMD19－T上，構建克隆質粒 pMD19－T－gsh I，并轉化E.coli JM109，得到E.coli JM109(pMD19－T－gsh I)，提取克隆質粒進行酶切驗證，送上海生工生物有限公司測序。

1.2.3 E.coli重組表達載體的構建 分別用限制性內切酶Sac I和HindⅢ酶切克隆質粒pMD19－T－gsh I和質粒pET－28a，酶切產物經膠回收純化，16℃連接過夜，轉化E.coli DH5α。抽提重組質粒，經酶切驗證后測序。

將重組表達質粒 pET－28a－gsh I熱激轉化到E.coli BL21(DE3)。

1.2.4 GSH I的誘導表達 挑取單菌落接入LB培養基(含100mg/mL Amp)，37℃培養至 OD550為 0.5左右時，在34℃，IPTG(0.1mmol/L)條件下，誘導表達。

1.2.5 SDS－PAGE檢測 按《分子克隆》［14］操作說明進行SDS－PAGE電泳后，考馬斯亮藍R－250染色，脫色過夜，觀察結果。

1.2.6 GSH I酶活性的測定 取5mL培養液12000×g離心5min，棄上清，用50mmol/L，pH7.0的磷酸緩沖液洗滌，離心后收集菌體。用同樣的磷酸緩沖液4mL懸浮菌體后超聲波破碎［15］，加入GSH前體反應液(谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸濃度均為40mmol/L，MgCl2和ATP濃度均為50mmol/L，GSH I濃度為2g/L)4mL，37℃反應 30min，沸水浴 2min以終止反應，用ALLOXAN試劑法［16］測GSH的生成量。酶活力單位(U)定義為37℃，pH7.0條件下，每分鐘催化合成1μg GSH所需的酶量。

1.2.7 GSH I的結構分析 利用DNAMAN軟件推導出目的基因的氨基酸序列，分析其與Gene bank數據庫中其它物種同源蛋白氨基酸序列的一致性。

通過蛋白分析專家系統(ExPASy，http://ca.expasy.org/)提供的分析工具分別預測蛋白質的理化性質、一級結構和二級結構。

利用3D－JIGSAW模擬GSH I的三級結構。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

以S.cerevisiae 2－10515基因組DNA為模板進行PCR擴增反應，擴增產物純化后電泳結果見圖1。圖1顯示:目的條帶在2000bp附近，與預計的條帶大小相吻合。

圖1 gsh I基因的PCR純化產物Fig.1 PCR purification product of gsh I

2.2 重組表達載體的構建

成功構建的表達載體pET－28a－gsh I的結構示意圖如圖2。將其用Sac I和HindⅢ酶切鑒定，結果如圖3。經酶切的重組質粒含有單一的約2Kb插入片段，這表明gsh I基因已插入質粒pET－28a中。測序結果證明閱讀框插入位點正確。

圖2 重組表達載體pET－28a－gsh I結構示意圖Fig.2 Construction of recombinant expression plasmid pET－28a－gsh I simple

圖3 重組質粒pET－28a－gsh I/Sac I+HindⅢ酶切鑒定Fig.3 pET－28a－gsh I digested by Sac I and Hind Ⅲ

2.3 SDS－PAGE電泳分析

SDS－PAGE電泳后考馬斯亮藍染色，脫色過夜，觀察結果如圖4所示:2、3、4泳道與陰性對照(1泳道)相比，在81Ku附近有一條明顯的蛋白條帶，除去載體上的his－tag(分子量約為3ku)，其實際的蛋白質分子量約為78ku，與預測的GSH I蛋白大小相符，很可能為表達的GSH I蛋白，該蛋白以融合蛋白的形式存在。

圖4 SDS－PAGE分析圖譜Fig.4 SDS－PAGE analysis of expression products

2.4 酶活力的測定

重組菌的GSH I活力測定結果見圖5，34℃誘導4h時，其活力達到46.09U/mg濕菌，隨著誘導時間的延長，GSH I活力并沒有增加，最佳誘導時間為4h。優化各種表達條件，酶活力無明顯改善。

圖5 重組菌GSH I酶活力曲線Fig.5 GSH I enzymatic activity curve of recombinant strain

2.5 GSH I基因的結構分析

2.5.1 Blast分析結果 該基因全長為2037bp，編碼678個氨基酸。對GSH I氨基酸序列進行同源多重序列比對(如圖6)發現:序列中部為保守序列，其關鍵氨基酸都在該保守序列中;與Gene bank中S.cerevisiae S288c、Macaca mulatta、Musmusculus、Branchiostoma floridae同源基因的氨基酸序列一致性分別為99%、42%、42%、41%。

圖6 GSH I的Clustal多重序列比對Fig.6 Multiple alignment of GSH I by Clustal

2.5.2 GSH I蛋白質的理化性質 利用ExPASy中ProtParam預測GSH I的理論分子量為78281.6u;等電點為5.87;含有9個半胱氨酸;其中第164位和第642位半胱氨酸有形成二硫鍵的可能性;該蛋白質的性質不穩定，在溶液中的不穩定指數為42.19，高于閾值40;脂溶性指數為77.52;親水指數(GRAVY)為－0.507，為親水性蛋白。其成熟肽N端為蛋氨酸時，在哺乳動物網狀紅細胞體外表達的半衰期為30h，在酵母和大腸桿菌中表達的半衰期分別為20、10h。

2.5.3 GSH I的二級結構 利用ExPASy中PredictProtein分析蛋白的拓撲結構和二級結構，該蛋白沒有信號肽，為非分泌蛋白;在253～272aa、285～308aa和484～511aa處有三個跨膜區;α－螺旋∶延伸鏈:β－折疊∶無規則卷曲 =35.10∶16.52∶8.85∶39.53，表明蛋白質二級結構的主要結構元件是α－螺旋和無規則卷曲，具有較多的無規則卷曲，不利于其穩定;mRNA的二級結構在起始密碼子處形成發卡結構。

2.5.4 GSH I的三級結構 將GSH I的氨基酸序列提交到3D－JIGSAW服務器預測GSH I三級結構，用Pymol軟件打開，如圖7所示，發現酶結構較松散，側鏈間相互作用不強，這與ProtParam的預測結果相一致。

圖7 GSH I三級結構圖Fig.7 3D structure of GSH I

3 結論與討論

已有學者在S.cerevisiae和Pichia pastoris中表達了 GSH I［17－18］，但這些報道中 GSH I 的表達量不高，酶活力也較低，使得構建好的菌株無法達到工業化生產的要求。S.cerevisiae是高產GSH的菌株，將其GSH I在E.coli中表達，有望構建高活性的GSH I重組菌，為工業化生產GSH奠定基礎。本研究成功克隆了S.cerevisiae 2－10515的gsh I基因，將編碼GSH I的基因定向克隆到pET－28a載體上，構建了重組菌株 E.coli BL21(DE3)/pET－28a－gsh I，34℃ 誘導 4h時，活力達到 46.09U/mg 濕菌，高于 Fan［17］、饒志明［18］等構建的重組菌株。

利用生物信息學方法分析S.cerevisiae 2－10515 GSH I序列可知:a.gsh I基因轉錄出的mRNA在5＇端起始部位區形成了發卡結構，有研究證實這種發卡結構會遮蔽SD序列和起始密碼子部位能阻止30s核糖體亞基的結合，從而減慢翻譯起始頻率［19］，降低相應蛋白質的表達量。B.GSH I在溶液中的不穩定指數為 42.19，高于閾值 40;GSH I親水指數為－0.507，為親水性蛋白;該酶分子中含有較多的無規則卷曲，結構比較松散。這些都說明GSH I穩定性較差［20］，不利于活性的提高。所以，從基因水平對S.cerevisiae 2－10515進行分子改造能進一步提高該酶的表達量和活性。

Huang［21］通過對 mRNA 結構的改造，消除了起始密碼子附近mRNA的二級結構，從而提高了木聚糖酶的表達量;Jeong［22］、Mahadevan［23］等通過同源建模及結構分析，利用定點突變增加了酶的穩定性。這些研究都為后續對S.cerevisiae GSH I分子改造提供了很好的基礎。本文在 E.coli中成功表達了S.cerevisiae來源的GSH I，為工業應用奠定了基礎;并對其進行了初步的生物信息學分析，為后續研究指明了方向。

［1］Grill E，L?ffler S，Winnacker E L，et al.Phytochelatins，the heavy metal binding peptides of plants，are synthesized from glutathionebyaspecific γ－glutamylcysteine dipeptidyl transpeptid－adse(phytochelatin synthase)［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86:6838－6840.

［2］ MeisterA.Glutathione metabolism and its selective modification［J］.Biol Chem，1988，263:27205－27208.

［3］Sanchez－Femandez R，Fricker M，Corben L B，et al.Cell proliferation and hair tip growth in the Arabidopsis root are under mechanistically different forms of redox control［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:2745－2750.

［4］楊培慧，齊劍英.谷胱甘肽的應用及其檢測方法［J］.中國生化藥物雜志，2002，23(1):52－54.

［5］冮潔，單立峰.谷胱甘肽的制備及其應用［J］.飼料工業，2007，28(15):15－17.

［6］周宇光，付國平，肖仔軍.谷胱甘肽的生產和應用研究進展［J］.食品工業科技，2003，24(3):89－91.

［7］Spector D，Laban J，Toledanom B.A genetic investigation of the essential role of glutathione［J］.Biol Chem，2001，276(10):7011－7016.

［8］Murata K，Miya T，Gushima H，et al.Cloning and amplification of a gene for glutathione synthetase in E.coli B［J］.A gric Biol Chem，1982，47:1381－1383.

［9］沈立新，魏東芝，趙哲峰，等.谷胱甘肽合成酶系的克隆、測序與表達［J］.生物工程學報:2001，17(1):98－100.

［10］Liao X Y，Shen W，Chen J.Improved glutathione production by gene expression in Escherichia coli［J］.Letters in Applied Microbiology，2006，43:211－214.

［11］Ohtake Y，Watanabe K，Tezuka H，et al.Expression of glutathione synthetase gene of Escherichia coli B in Saccharomyces cerevisiae［J］.J Ferment Bioeng，1989，68(6):390－394.

［12］黃培堂 .分子克隆實驗指南［M］.北京:科學出版社，2005.

［13］周小玲，沈微，饒志明，等.一種快速提取真菌染色體DNA 的方法［J］.微生物學通報，2004，31(4):89－92.

［14］Sambrook J，E F Fritsch，T Maniatis.Molecular cloning:A laboratory manual(Second edition)［M］.NY:Cold spring harbor laboratory，1989.

［15］沈立新，魏東芝，趙哲峰，等.谷胱甘肽合成酶在大腸桿菌中的高效表達及性質［J］.華東理工大學學報，2000，26(4):342－345.

［16］李從軍，謝愛娣.酵母提取液中谷胱甘肽定量測定方法的比較［J］.食品發酵工業，2010，36(7):158－162.

［17］Fan XY，He XP，Guo XN，et al.Increasing glutathione formation by functional expressing of the γ－glutamylcysteine synthetase gene in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnol Lett，2004，26(5):415－417.

［18］饒志明，艾麗靜，沈微，等.gsh I基因的克隆及其在巴斯德畢赤氏酵母中的表達［J］.應用與環境生物學報，2007，13(2):257－260.

［19］Cruz－Vera L R，Magos－Castro M A，Zamora－Romo E，et al.Ribosome stalling and peptidyltRNA drop－ off during translational delay at AGA codons［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(15):4462－4468.

［20］王大成.蛋白質工程［M］.北京:化學工業出版社，2002.

［21］Huang H Q，Yang P L，Luo H Y，et al.Hingh－level expressin of a truncated 1，3－1，4－β－D－glucanase from Fibrobacter succinogenes in Pichia pastoris by optimization of codons and fermentation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78(1):95－103.

［22］Jeong M Y，Kim S，Yun C W，et al.Engineering a denovo internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from Bacillus stearothermophilus No.236［J］ .J Biotechnol，2007，127(2):300－309.

［23］Mahadevan S A，Wi S G，Lee D S，et al.Site－directed mutagenesisand CBM engineering ofCel5A(Thermotoga maritima)［J］.FEMS Microbiol Lett，2008(2):205－211.