免疫磁珠法富集沙門氏菌的優化及應用

山 珊，牛瑞江，賴衛華，劉道峰，魏 華，熊勇華

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學，江西南昌330047)

沙門氏菌是自然界普遍存在的一種食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例數占第一位［1］，常引起人類急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾病［2］。沙門氏菌危害較大，在2006年歐盟調查中大約有160049人被確認感染了沙門氏菌［3］。2008年4～8月，美國有286人感染，2人死亡［4］。2010年美國因沙門氏菌污染，召回了約5億枚污染雞蛋。2010年在日本4090個農場中抽取203個調查，結果有48個農場顯示陽性，占調查的23.6%［5］。2012年美國食品和藥品監管局(FDA)統計，美國每年大約有400人死于沙門氏菌感染。為了加快沙門氏菌的檢測速度，人們采用免疫磁珠的方法對樣品進行富集。王海明等利用英國Matrix公司的Pathetrix免疫磁分離系統進行動態富集，目標菌捕獲效率的平均值達到60%，三種濃度的沙門氏菌添加到8種食品基質中，目標菌捕獲效率的平均值是23%［6］。張東方等［7］將免疫磁捕獲和實時熒光PCR技術結合起來，16h內檢測雞肉中的沙門氏菌，檢測限為104CFU/mL。王曉聞等［8］免疫磁珠捕獲和PCR技術結合起來，在7h內檢測了牛乳中的沙門氏菌，檢測靈敏度為9CFU/mL。然而，目前未見采用免疫磁珠法對多種代表性的沙門氏菌進行系統研究的文獻報道。本文專注于免疫磁富集的研究，較為系統地優化了沙門氏菌抗體與磁珠的多種偶聯條件和免疫磁珠捕獲工藝，用所制備的免疫磁珠對鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌和腸炎沙門氏菌五種具有代表性的沙門氏菌進行富集，并在食品基質中得到應用。本方法特異性強，準確性高，使用方便，結合前端的選擇性增菌和后端的免疫層析分析，可以建立起完整的沙門氏菌快速檢測系統。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬霍亂沙門氏菌(ATCC 10708)、甲型副傷寒沙門氏菌(ATCC 9150)、(鴨沙門氏菌ATCC 9150)、腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 13311)、單核細胞增生李斯特氏菌(CMCC 54001)、大腸埃希氏菌(O157∶H7 CMCC 44828)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003) 均為本實驗室保存;沙門氏菌多克隆抗體 本實驗室制備;溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;MES Alafa公司;EDC、NHSS PIERCE公司;SM3-P100磁珠、PM3-020磁珠 上海奧潤微納新材料科技有限公司。

BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜 蘇州安泰;ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器 上海智誠;TGL-16臺式離心機 湖南湘儀;日立H-7500型透射電鏡HITACHI;NICOMP380/ZLS型納米粒度分析儀 英國PSS粒度分析儀公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔抗沙門氏菌免疫磁珠的制備及優化 取少量磁珠到離心管中，磁分離后棄上清，乙醇清洗后用PBS溶液調磁珠到合適濃度，超聲處理，采用透射電鏡觀察磁珠的形狀、大小和表面形態等特征。用活潑酯法將PM3-020磁珠表面的羧基活化，加入一定量的純化后的兔抗沙門氏菌抗體［9］，其中磁珠用量分別取 0.05、0.2、0.4、0.5、1.0mg，抗體添加量分別取 10、20、30、50、75、100μg。將沙門氏菌接種到 LB 培養基中過夜培養，用平板涂布計數法計數后，再經濃度梯度稀釋將菌液濃度調整為105CFU/mL。不同條件的免疫磁珠與相同濃度的菌懸液均勻混合，用0.1%蛋白胨水定容至1mL。室溫孵育45min，轉速30r/min，磁力架分離3min，取上清，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，將分離出來捕獲有沙門氏菌的免疫磁珠、上清液和洗脫液采取合適的梯度，進行菌落計數［10］，每個梯度三個平行，所有的平板培養溫度為(37±1)℃，時間為18～24h。通過平板計數法計算菌液的濃度，計算其捕獲效率，免疫磁珠的捕獲效率公式如下:

捕獲效率(%)=磁珠捕獲菌落總數/(磁珠捕獲菌落總數+上清液中菌落總數+洗滌液中菌落總數)×100

1.2.2 免疫磁珠捕獲工藝的優化 分別對免疫磁珠捕獲過程中的菌濃度、反應時間、磁分離時間、磁場強度以及不同粒徑大小磁珠進行優化。所選的菌濃度為 106、105、104、103、102CFU/mL;免疫磁珠與菌液的反應時間為10、30、45、60min;磁分離時間設為1、3、5、7min;再磁分離時采用磁場強度分別為 0.4、0.8、1.5T的磁分離器進行比較;取180和1150nm粒徑的免疫磁珠與105CFU/mL濃度的菌懸液均勻混合，比較捕獲效率。

1.2.3 免疫磁珠在雜菌體系中捕獲效率的比較 將鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌分別接種到LB中培養，將雜菌濃度調整為大約106CFU/mL后，取1mL菌液與免疫磁珠混合。孵育、磁分離，取上清，清洗兩次，采用固體培養基進行菌落計數。

1.2.4 不同菌屬捕獲效率比較 將鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鴨沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌活化后分別接種到LB培養基中過夜培養，將菌液濃度調整為大約105CFU/mL后，取1mL菌液與免疫磁珠混合。孵育、磁分離，取上清，清洗兩次，采用固體培養基進行菌落計數。

1.2.5 免疫磁珠在實際樣品中富集 稱取牛奶和雞蛋樣品25g或25mL，加入到225mL BPW中，接種一定濃度的沙門氏菌，(36±1)℃，時間為8～18h。取1mL菌液與免疫磁珠混合。孵育、磁分離后，取上清，清洗兩次，采用固體培養基進行菌落計數。

2 結果與分析

2.1 透射電鏡表征

從圖1中透射電鏡照片可以看出，奧潤PM3-020磁珠外觀成球性較好，球體表面均勻，無雜質粘連，放大倍數為35.0×1000。從圖2可得，磁珠偶聯抗體前平均粒徑為194.3nm，粒徑分布較窄，多分散指數(PDI)為0.104，分散性好;磁珠偶聯抗體后所得免疫磁珠的平均粒徑為215nm，多分散指數(PDI)為0.163;免疫磁珠BSA封閉后的平均粒徑為256.1nm，多分散指數(PDI)為0.189。

圖1 羧基磁珠透射電鏡照片Fig.1 TEM of carboxylated magnetic nanobeads

圖2 磁珠粒徑變化圖Fig.2 Changes of magnetic beads size distribution

2.2 偶聯抗體不同添加量結果和免疫磁珠工作濃度的確定

從圖3可以看出，在制備免疫磁珠時，當抗體的濃度小于50μg/mg時，羧基化磁珠對抗體的吸附量隨著抗體質量濃度的增加而增加。當抗體的質量濃度大于50μg/mg，羧基化磁珠對抗體的吸附量反而會下降。實驗可得出抗沙門氏菌抗體中的飽和吸附量是50μg/mg。當免疫磁珠的量增加到0.4mg時，捕獲效率基本保持穩定。磁珠是通過抗原抗體特異性結合來捕獲菌，當菌的表面結合了足夠量的磁珠時，再加入磁珠，菌的捕獲量幾乎不會有太明顯的提高，所以選擇0.4mg為最佳添加量。

圖3 偶聯抗體不同量以及免疫磁珠不同添加量捕獲效率比較Fig.3 Comparison of the capture efficiency of different amount of antibody with the same bead and different magnetic immunobeads concentration

2.3 免疫磁珠捕獲不同菌濃度結果和免疫磁珠與菌液最佳反應時間結果

從圖4中可看到，比較不同菌濃度在純培養體系中的捕獲效率，菌液濃度為102～106CFU/mL，捕獲效率為65%～82%，說明捕獲效率比較穩定。磁珠的添加量是固定不變的，隨著菌液濃度的增加而捕獲效率降低的趨勢比較小，這說明磁珠的濃度已經達到飽和狀態。

在比較孵育時間圖中可看到，從左至右的捕獲效率分別為32.7%、45.9%、72%、73.2%。磁珠與菌液共孵育的時間越長，捕獲效果越好，但是當孵育時間大于45min，效果就不明顯了。結果說明孵育45min為最佳孵育時間。

圖4 不同菌濃度捕獲效率比較以及不同孵育時間捕獲效率比較Fig.4 Comparison of the capture efficiency of different concentration of Salmonella with the same bead concentration and the capture dynamics charts of different immuno-reaction time

2.4 磁分離最佳時間、磁場強度和磁珠直徑的確定結果

從圖5可看到，在免疫磁分離圖表中從左至右捕獲效率分別為60.3%、83.2%、81.5%、78.3%。捕獲效率隨著時間延長到3min時達到最高，時間再延長捕獲效率反而降低，說明3min為最佳磁分離時間。

在不同磁場強度的比較圖中，磁場強度分別為0.4、0.8、1.5T，當磁分離時間是 3min時，磁場強度對捕獲效率影響不明顯，免疫磁珠添加量為0.4mg，孵育時間45min，捕獲效率分別為57.39%、60.76%和63.74%。從安全考慮選擇0.8T的磁分離器。

分別選用 PM3-020(180nm)和 SM3-P100(1150nm)粒徑的免疫磁珠在純培養體系中捕獲目的菌，從不同磁珠直徑比較的圖中可看出，兩種不同粒徑的磁珠捕獲時磁珠添加量為0.4mg、孵育時間為45min、磁分離時間為3min，捕獲效率分別為65.8%和31.2%，結果說明在純培養體系中納米磁珠優于微米磁珠。

圖5 不同磁分離時間、磁場強度和磁珠直徑捕獲效率比較Fig.5 Comparison of the capture efficiency of different immunomagnetic separation time and different food matrix and different size beads with the same bead concentration

2.5 特異性實驗結果

由圖6可見，目的菌中分別添加106CFU/mL的大腸桿菌O157∶H7、106CFU/mL的單核增生李斯特CMCC 54007和106CFU/mL的金黃色葡萄球菌CMCC26003，目的菌捕獲效率分別為51.9%、56.4%、60.1%，雜菌捕獲效率為5.6%、1.77%、1.06%，雜菌的捕獲效率低，結果說明免疫磁珠的特異性好，雜菌的干擾少。

圖6 特異性實驗Fig.6 Specificity Test

2.6 對不同菌屬捕獲效率結果和食品基質結果分析

將免疫磁珠分別捕獲鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium，S.T)、豬霍亂沙門氏菌(SalmonellaCholeraesuis，S.C)、甲型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaParathpyiA，S.P)、鴨 沙 門 氏 菌(SalmonellaAnatum，S.A)和腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis，S.E)，捕 獲 效 率 分 別 為61.4% 、45.8% 、48.2% 、78.5% 、64.1% 。

由圖7可知，純培養、蛋清、蛋黃和牛奶基質的捕獲效率分別為68.3%、44.3%、43.2%、65.2%。在牛奶基質中捕獲效率65.2%接近純培養捕獲效率68.3%，說明牛奶基質對捕獲目的菌的干擾小;在蛋清和蛋黃基質中捕獲效率為44.3%和43.2%，與純培養捕獲68.3%有一定差距，說明蛋清和蛋黃基質對捕獲目的菌的干擾較大。

圖7 不同菌株和不同食品基質捕獲效率比較Fig.7 Comparison of the capture efficiency of different strain and different food matrix with the same bead concentration

3 結論與討論

制備捕獲效率高的免疫磁珠時，選擇粒徑均勻的磁珠是制備免疫磁珠的一個重要前提，影響磁珠性能的因素有粒徑大小、顆粒分散性、表面修飾基團分布、磁響應性、沉降速度等［11］。為了更好地提高磁珠的生物相容性和生物特異性，實驗中采用交聯劑將特異性抗體氨基與表面修飾有羧基的納米磁珠偶聯，偶聯過程中，EDC起到活化磁珠表面羧基的作用，反應形成活潑酯，由于生成的活潑酯在溶液中不穩定易水解，為此立即加入NHSS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，生成穩定的NHSS酯，同時達到活化羧基的目的，活化好的磁珠與抗體的氨基共價反應生成免疫磁珠［12］。整個制備過程包括活化、偶聯、封閉與保存四個過程，在偶聯過程中有時出現磁珠絮集沉降現象，實驗采取超聲進行分散，起到了很好的效果，得到分散性好的免疫磁珠。

國外商品化的免疫磁珠大多數是微米級的，微米級的免疫磁珠由于磁性較強，在大體系動態富集過程中有一定的優勢。本研究為小體系靜態富集過程，實驗結果表明，納米級免疫磁珠(180nm)的捕獲效率優于微米級免疫磁珠(1150nm)。沙門氏菌表面結合磁珠的容量取決于兩個參數，一是沙門氏菌表面(直徑為0.5μm，長度為2μm)具有的抗原表位數量，另一個則取決于磁珠的體積大小。由于空間位阻的原因，磁珠體積大，磁珠與細菌可結合的位點將減少;磁珠體積小，磁珠與細菌表面可結合的量增加。當磁珠直徑為200nm左右時，細菌表面可結合的磁珠量最大可能是100個左右，因此可以連接較多的免疫磁珠，從而細菌可以有效地被捕獲;而微米級磁珠，由于空間位阻的原因，細菌表面與磁珠的結合位點下降為只有幾個，細菌不容易被免疫磁珠所捕獲。

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