基于BP神經網絡和析因設計的土壤中EE2和BPA超聲輔助生物降解模型

李 魚,張 琛,周長志,孟 沖

(華北電力大學 資源與環境研究院,北京 102206)

雌激素(endocrine disrupting chemicals,EDCs)是一類通過影響內分泌系統功能,破壞生物體維持機體穩定性和調控作用的物質[1].乙炔基雌二醇(EE2)和雙酚A(BPA)均為人工合成雌激素,在工業生產、畜牧業和醫藥業中應用廣泛.EE2是養殖業飼料、口服避孕藥和激素補充用藥的主要成分,在ng/L量級即具有較強的內分泌干擾性[2-3].EE2進入自然水體后,可誘導雄性魚類體內蛋白的合成,從而影響魚類的繁殖能力[4].BPA作為化工原料廣泛用于食品包裝和塑料器具,在微量水平下即可表現雌激素效應,影響人類和動物的生殖及內分泌系統[5].雌激素化合物進入環境后,在自然水體、沉積物、地下水以及土壤中均有不同程度的殘留[6-8].

生物降解可在保證不引入二次污染物的前提下有效去除環境中有機污染物.本文選取惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)對人工合成雌激素EE2和BPA進行超聲輔助生物降解.將碳源添加量、氮源添加量、接種量、超聲時間和降解時間作為輸入,EE2和BPA的降解率作為輸出,分別構建超聲輔助生物降解EE2和BPA的BP神經網絡模型[9-12].利用BP神經網絡預測不同25-1析因設計[13]條件下對應的生物降解率(響應值),并分析了影響因子的主效應和交互作用,進而求解土壤-水體系中EE2和BPA的最優生物降解條件.針對EE2和BPA的生物降解差異性,結合污染物自身的移動性和持久性探討其降解機理.

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

17α-乙炔基雌二醇(質量分數>97%,德國Sigma公司)；雙酚A(質量分數>99%,美國Aldrich公司)；甲醇(色譜純,美國Burdick &Jackson公司)；氯化鈣和氫氧化鈉(優級純,北京化工廠)；用甲醇配制雌激素的混合儲備液(20 mg/L)于4 ℃冰箱中保存,標準曲線溶液由混合儲備液稀釋配制而成.

高效液相色譜儀(Agilent 1200型,美國Agilent公司)；分析天平(FA1004型,上海海鷗儀器有限公司)；回旋式振蕩器(HY-5型,江蘇金壇市環宇科學儀器廠);數控超聲波清潔器(KQ3200DE(0～150 W)型,昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司).

1.2 惡臭假單胞菌培養基的制備材料

富集培養基的制備：酵母浸粉5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉10.0 g,蒸餾水1.0 L,調節pH≈7.0.無機鹽培養基的制備：磷酸氫二鉀4.35 g,磷酸二氫鉀1.70 g,硫酸鎂0.20 g,氯化銨2.10 g,硫酸錳0.05 g,七水合硫酸亞鐵0.01 g,結晶水氯化鈣0.03 g,蒸餾水1.0 L,pH=6.8～7.0.

1.3 惡臭假單胞菌的富集培養

將實驗室保存完好的斜面培養基在37 ℃恒溫條件下活化24 h后,在超凈工作臺中采用接種環挑取菌落,接種于500 mL富集培養基的錐形瓶中,瓶口用8層紗布和報紙包扎,置于37 ℃培養箱中培養24 h.重復富集細菌兩次,第二次接種液取自第一次培養液.

1.4 雌激素生物降解

在盛有50 mL無機鹽培養基的錐形瓶中加入定量的雌激素溶液后,接入不同體積的菌液,于37 ℃培養箱中避光培養7 d,每24 h取樣一次,考察惡臭假單胞菌對雌激素的生物降解規律.同時在50 mL具有一定濃度雌激素的無機鹽培養基中接入8.0 mL菌液(OD600≈0.8,處于對數生長期),在功率為30 W,分別超聲1,5,10,15 min,每隔24 h取樣一次,取樣后即對溶液進行超聲作用,并置于37 ℃培養箱中避光培養7 d,設兩個平行樣.實驗將未接入惡臭假單胞菌菌液的雌激素溶液設置為空白對照.考察超聲波作用對惡臭假單胞菌生物降解雌激素的影響.根據上述實驗方法,分別考察以碳源添加量、氮源添加量、惡臭假單胞菌接種量、超聲輔助時間和降解時間為降解影響因子的單因素實驗,共60組.隨機選取30組數據作為BP神經網絡建模的訓練集,20組數據作為建模的驗證集和測試集,10組作為預測集以檢驗模型精度.

1.5 雌激素的檢測條件

采用高效液相色譜對雌激素進行分離.流動相為甲醇和純凈水.EE2和BPA檢測的洗脫程序為：0～4 min內V(甲醇)∶V(水)由0.8降至0.7,4～10 minV(甲醇)∶V(水)=0.7,后運行時間設定為8 min；流速：1.0 mL/min.采用Agilent ZORBAX SB-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為30 ℃；可變波長紫外檢測器的檢測波長λ=280 nm.

2 結果與討論

2.1 EE2和BPA降解的BP神經網絡模型建立

2.1.1 BP神經網絡模型結構 將影響EE2和BPA生物降解的因素：碳源添加量(X1)、氮源添加量(X2)、底物濃度(X3)、超聲時間(X4)和降解時間(X5)作為5個輸入變量,EE2和BPA的生物降解率(Y)作為1個輸出變量,表達式為

Y=f(X1,X2,X3,X4,X5),

隱層節點數設為9,構建三層前向反饋5×9×1結構模型.訓練目標設為5.0×10-5,學習效率為0.01.將30組數據用于模型的訓練集,20組數據用于驗證集和測試集,以驗證模型的泛化能力.通過對模型的反復網絡訓練,確定能正確反映雌激素EE2和BPA在土壤-水系統中降解的BP神經網絡模型.

2.1.2 EE2和BPA降解的BP神經網絡模型精度分析 為驗證建立模型的準確性和有效性,本文隨機選取10組實驗數據作為預測集樣本用于檢驗模型的預測能力.采用相關系數(R2)和模擬效率系數(NSC)考察建立模型的預測能力和精度,結果如圖1所示.

圖1 EE2(A)和BPA(B)生物降解率檢驗樣本的相關性分析Fig.1 Correlation analysis between experimental and predictive degradation rates of EE2 (A) and BPA (B)

若BP神經網絡模型輸出的預測值和實驗值的R2>0.90,則模型的預測能力較高;若R2<0.90,則模型的預測能力具有局限性[14].由圖1可見,散點均勻分布于直線兩側,表明模型的預測值和實驗值具有較高的契合度.EE2和BPA在土壤-水體系中降解率的實驗值和預測值的R2分別為0.952 5和0.983 1.

本文考察了EE2和BPA在土壤-水體系中生物降解的模擬效率系數(NSC)取值,表達式為

(1)

NSC值越接近1,預測值和實驗值的匹配程度越高.結果表明,土壤-水體系中EE2和BPA生物降解模型的NSC分別為0.956 5和0.957 2,即模型具有較高的精度.EE2和BPA神經網絡模型的驗證集、測試集和預測集均方差分別為0.007 0,0.445 6,0.101 4和0.006 9,0.500 6,0.718 5,表明模型預測值和實驗值的吻合度較高.

2.2 EE2和BPA降解的析因設計

本文將影響生物降解的條件(X1,X2,X3,X4,X5)設置為自變量,EE2和BPA的生物降解率(Y1和Y2)設置為響應值,采用25-1分式析因設計雌激素降解實驗,析因設計因素水平列于表1.

表1 25-1析因設計因素水平Table 1 Factors and levels of 25-1 factorial design

利用已建立的BP神經網絡模型預測25-1分式析因設計的響應值,降解實驗數據列于表2.基于BP神經網絡模型對降解率的預測結果,對影響生物降解的各因素進行分析.當顯著性水平p<0.05時,選取主要影響因子作為回歸方程的自變量,EE2的降解率作為回歸方程的因變量,其多元回歸方程表達式為

其中:一元自變量系數的正負表示與降解率成正比或反比;二元自變量系數的正負表示二階交互作用對生物降解效果的協同作用或拮抗作用.

表2 25-1析因設計實驗Table 2 Experimental arrangement of 25-1 factorial design

EE2影響因子的Pareto分布如圖2所示.由圖2可見,主因子X3,X4和X5以及交互作用X1×X2和X1×X3的Pareto百分比平方和均大于10,即上述因子對EE2降解率的影響較大.由式(2)可見:主因子X3和X5與Y1成正比,X4與Y1成反比；交互作用X1×X2和X1×X3在EE2降解過程中具有協同作用.

當顯著性水平p<0.05時,建立以BPA降解率為因變量的多元回歸方程,其表達式為

BPA影響因子的Pareto分布如圖3所示.由圖3可見，主因子X2,X4以及交互作用X1×X2,X1×X3和X2×X3的百分比平方和均大于10,即上述因子對BPA降解率的影響較大.由式(3)可見:主因子X2與Y2成正比,X4與Y2成反比；在降解過程中,二元交互作用X1×X2,X1×X3具有協同作用,X2×X3具有拮抗作用；X4在EE2和BPA的降解過程中均為負效應.

圖2 EE2影響因子的Pareto分布Fig.2 Pareto distribution of EE2 factors

圖3 BPA影響因子的Pareto分布Fig.3 Pareto distribution of BPA factors

2.3 雌激素生物降解條件優化

本文考察了各影響因子對EE2和BPA降解效果影響的趨勢,結果如圖4所示.

圖4 EE2和BPA的因素影響趨勢Fig.4 Influence tendency of factors for EE2 and BPA

由圖4可見:影響因子X1～X5對Y1和Y2的影響趨勢基本一致.隨著X1,X2,X3和X5水平取值的增大,Y1和Y2呈增大趨勢并在高水平處達到最大值;隨著因子X4水平取值的增大,Y1和Y2呈下降趨勢.因此在降解過程中為微生物提供充足的碳源和氮源,可使惡臭假單胞菌處于生長對數期,選擇適宜的超聲時間可促進惡臭假單胞菌的生物活性,提高細菌的代謝作用,從而增強EE2和BPA的降解效果.

通過對EE2和BPA影響因子趨勢的對比分析可獲得土壤-水體系中EE2和BPA的最優降解條件為：10%的碳源添加量；10%的氮源添加量；接種量為20 mL；超聲時間為1 min；降解時間為168 h.各因子對EE2和BPA在土壤-水體系中降解的影響趨勢與文獻[15]結果一致.在最優降解條件下,利用已建立的多元回歸模型預測EE2和BPA的最大降解率分別為87.13%和69.27%.

2.4 雌激素降解機理分析

在相同生物降解條件下,EE2和BPA在土壤-水體系中的降解效果差異較大.EE2和BPA的有機碳標化系數(lgKoc)和半衰期列于表3.

表3 EE2和BPA的化學參數Table 3 Chemical parameters of EE2 and BPA

lgKoc-降解率和半衰期-降解率的線性方程表達式分別為:

DR=255.14 lgKoc-1 099.27,

(4)

DR=-0.72HL+90.87,

(5)

其中:DR為EE2和BPA的降解率;lgKoc和HL分別表示EE2和BPA有機碳標化系數和半衰期.由表3可見,EE2的lgKoc大于BPA的lgKoc，EE2的半衰期小于BPA的半衰期.由式(4)和式(5)可見,EE2和BPA的lgKoc與其降解率成正比,半衰期與降解率成反比.因此,EE2和BPA的降解效果存在差異是由于雌激素在土壤-水體系中的移動性強弱不同及雌激素在環境中的持久性不同所致.

[1] Snyder S A,Westerhoff P,Yoon Y,et al.Pharmaceuticals,Personal Care Products,and Endocrine Disruptors in Water:Implications for the Water Industry [J].Environ Eng Sci,2003,20(5):449-469.

[2] Puma G L,Puddu V,Tsang H K,et al.Photocatalytic Oxidation of Multicomponent Mixtures of Estrogens (Estrone (E1),17β-Estradiol (E2),17α-Ethynylestradiol (EE2) and Estriol (E3)) under UVA and UVC Radiation:Photon Absorption,Quantum Yields and Rate Constants Independent of Photon Absorption [J].Appl Catal B:Environ,2010,99(3/4):388-397.

[3] Edelman A B,Cherala G,Munar M Y,et al.Prolonged Monitoring of Ethinyl Estradiol and Levonorgestrel Levels Confirms an Altered Pharmacokinetic Profile in Obese Oral Contraceptives Users [J].Contraception,2013,87(2):220-226.

[4] Reyhanian N,Volkova K,Hallgren S,et al.17α-Ethinyl Estradiol Affects Anxiety and Shoaling Behavior in Adult Male Zebra Fish (Daniorerio) [J].Aquat Toxicol,2011,105(1/2):41-48.

[5] CHEN Min-yu,Ike M,Fujita M.Acute Toxicity,Mutagenicity,and Estrogenicity of Bisphenol-A and Other Bisphenols [J].Environ Toxico,2002,17(1):80-86.

[6] Fent G,Hein W J,Moendel M J,et al.Fate of14C-Bisphenol A in Soils [J].Chemosphere,2003,51(8):735-746.

[7] LIU Ze-hua,Kanjo Y,Mizutani S.Urinary Excretion Rates of Natural Estrogens and Androgens from Humans,and Their Occurrence and Fate in the Environment:A Review [J].Sci Total Environ,2009,407(18):4975-4985.

[8] Staples C A,Dome P B,Klecka G M,et al.A Review of the Environment Fate,Effect,and Exposures of Bisphenol A [J].Chemosphere,1998,36(10):2149-2173.

[9] ZHU Shun-quan.The Application of BP Neural Network in the Cash Flow Analysis Based on Matlab [J].China Management Informationization,2008,11(6):39-40.(朱順泉.基于Matlab的BP神經網絡在現金流量分析中的應用 [J].中國管理信息化,2008,11(6)：39-40.)

[10] LI Yu,ZHENG Shuang,WANG Jiang-ling,et al.Reaction Condition Optimization of Butyric Acid under Catalytic Wet Air Oxidation Based on BP Artificial Neural Network Model [J].Journal of Jilin University:Science Edition,2009,47(2):397-402.(李魚,鄭爽,王江玲,等.基于BP神經網絡模型的催化濕式氧化正丁酸反應條件的優化 [J].吉林大學學報:理學版,2009,47(2)：397-402.)

[11] GAO Qian,WANG Qian,WANG Zhi-zeng,et al.Modeling of Atrazine Adsorption on Sediments in Ternary System of Cadmium-Copper-Atrazine [J].Advances in Science and Technology of Water Resources,2011,31(1):37-41.(高茜,王倩,王志增,等.鎘-銅-阿特拉津三元復合體系中沉積物吸附阿特拉津過程的模型研究 [J].水利水電科技進展,2011,31(1)：37-41.)

[12] ZHANG Chen,LIU Jian-lin,HU Yan,et al.Application of BP Neural Network to the Adsorption of Bisphenol A onto Surfacial Sediments and Their Non-residual Fractions [J].Scientia Geographica Sinica,2010,30(3)：435-440.(張琛,劉建林,胡艷,等.BP神經網絡模型在表層沉積物及其非殘渣態組分吸附雙酚A研究中的應用 [J].地理科學,2010,30(3)：435-440.)

[13] Ven P M,Van de,Bucchianico A D.On the Equivalence of Definitions for Regular Fractions of Mixed-Level Factorial Designs [J].J Stat Plan and Infer,2009,139(7):2351-2361.

[14] 雷英杰.MATLAB遺傳算法工具箱及應用 [M].西安:西安電子科技大學出版社,2005.

[15] LIU Jian-lin.Study on the Adsorption Behaviors and Biodegradation of Estrogen Chemicals in Soil System [D].Beijing:North China Electric Power University,2012.(劉建林.雌激素化合物在土壤中的吸附行為及生物降解的研究 [D].北京：華北電力大學,2012.)

[16] Lee L S,Strock T J,Sarmah A K,et al.Sorption and Dissipation of Testosterone,Estrogens,and Their Primary Transformation Products in Soils and Sediment [J].Environ Sci Technol,2003,37(18):4098-4105.

[17] Lim S J,Fox P.Estimating the Persistence of Organic Contaminants in Indirect Potable Reuse Systems Using Quantitative Structure Activity Relationship (QSAR) [J].Sci Total Environ,2012,433:1-7.

[18] YING Guang-guo,Kookana R,Waite T D.Australian Water Conservation and Reuse Research Program:Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) and Pharmaceuticals and Personal Care Products (PPCPs) in Reclaimed Water in Australia [M].Sydney:CSIRO &AWA,2004.