靶向沉默人HER2/neu基因的RNA干擾

雷莉妍,孫曉莉,朱利民,修志明,王麗萍,

(1.吉林大學 生命科學學院,長春 130012；2.吉林大學 中日聯誼醫院急救醫學科,長春 130033；3.博迅生物技術有限責任公司,長春 130012)

過表達HER2/neu可促進乳腺癌細胞的遷移[1-5].利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術可從基因水平上抑制HER2/neu.RNA干擾是一種有效的沉默基因方法,是由21-23 mer雙鏈RNA介導后轉錄水平的基因沉默[6],如siRNA和shRNA.其中合成的siRNA介導干擾僅產生瞬時效果,shRNA可將干擾片段整合至真核表達載體上,并帶入細胞,一定時間內可持續形成shRNA,被Dicer酶剪切為siRNA,從而達到長期的RNA干擾效果[7-14],具有特異性、快速性、遺傳性和高效性等特點.

本文構建了針對人乳腺癌HER2/neu的shRNA干擾載體,轉染高表達HER2/neu的人乳腺癌細胞SK-BR-3,并觀察shRNA對HER2/neumRNA和蛋白的作用效果及對SK-BR-3細胞遷移能力的影響,以篩選有效的干擾靶點,為進一步研究HER2/neu蛋白功能提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

熒光實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑購自大連寶生物有限公司；人乳腺癌細胞SK-BR-3購自北京協和細胞庫；RPMI 1640和OPTI-MEM培養基購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Thermo Scientific公司；pSUPERIOR.puro質粒購自美國Oligoengine公司；pEGFP-N1質粒購自美國BD Biosciences Clontech公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；BglⅡ和HindⅢ購自大連寶生物工程有限公司；蛋白免疫印跡試劑均購自武漢博士德公司;山羊抗人HER2/neu多克隆抗體(sc-31154)和小鼠抗人β-actin單克隆抗體(sc-8432)購自美國Santa Cruz公司.

1.2 方 法

1.2.1 shRNA的設計 本文篩選出HER2/neumRNA (NM_001005862.1)中的3段核苷酸序列作為靶點,根據siRNA的設計原則設計了shRNAs,分別命名為HER2/neu-shRNA-1,HER2/neu-shRNA-2,HER2/neu-shRNA-3和陰性對照HER2/neu-shRNA-C.由文獻[15]可知,該陰性對照不具靶向沉默功能.設計的序列由上海生物工程有限公司合成.

1.2.2HER2/neushRNA干擾載體的構建 將pSUPERIOR.puro質粒分別用限制性內切酶BglⅡ和HindⅢ于37 ℃水浴中酶切2 h,與退火產物(dsDNA)在37 ℃水浴中連接過夜.連接產物轉化至感受態DH-5α大腸桿菌上,于固體選擇培養基上37 ℃選擇培養,挑取陽性克隆提取質粒酶切,產物用質量分數為2%的葡聚糖凝膠分離鑒定,并由深圳華大基因研究院測序.

1.2.3 細胞培養及給藥處理 乳腺癌細胞SK-BR-3用RPMI 1640完全培養基(含體積分數為10%的胎牛血清,1.667 μkat/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)在37 ℃含體積分數為5%的CO2恒溫培養箱內培養.將細胞接種于6孔板中用不含雙抗的培養基培養.24 h后,用LipofectamineTM2000作為載體進行轉染.轉染48 h后用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白(GFP)的表達.轉染24 h后檢測HER2/neumRNA水平；轉染48 h后檢測HER2/neu蛋白水平.

1.2.4 實時定量PCR檢測HER2/neumRNA的變化 本文用實時定量PCR檢測HER2/neumRNA的變化，以β-actin作為內參[11].實時定量PCR條件：1) 94 ℃變性30 s；2) 58 ℃退火30 s；3) 72 ℃延伸30 s,循環45次,最后72 ℃延伸10 min.HER2/neumRNA相對表達量=2-Δ CT,其中:ΔCT=(CT目的-CT參比)實驗-(CT目的-CT參比)對照;CT表示反應過程中管內熒光信號達到閾值時的擴增循環數.

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測HER2/neu蛋白量的表達 細胞總蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后,轉至硝酸纖維素膜上,封閉液封閉2 h后,將膜置于山羊抗人HER2/neu或小鼠抗人β-actin一抗溶液中,4 ℃孵育過夜.洗脫液洗膜3次,用辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗溶液在室溫下孵育膜1 h,用化學發光法顯色.β-actin作為內參.

1.2.6 細胞劃痕實驗 當生長在12孔板中的SK-BR-3細胞在70%～80%匯合時,用移液槍頭劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,去除脫壁的細胞,將劃痕拍照.細胞轉染48 h后再次拍照.根據劃痕寬度變化判斷SK-BR-3細胞的遷移情況[12].

1.3 數據統計

采用統計學軟件SPSS 10.0進行數據統計分析,結果以平均值±標準差表示,組間比較采用Student’st-test進行顯著性檢驗,P<0.05表示具有顯著的統計學差異.

2 結果與分析

2.1 重組質粒構建

構建的重組質粒經測序比對,結果與設計序列完全吻合,表明HER2/neu基因shRNA表達質粒構建成功.干擾序列列于表1.

表1 HER2/neu基因的特異性干擾片段Table 1 Target sequences of HER2/neu gene for RNAi

2.2 轉染48 h后報告基因GFP的表達

本文用pSUPERIOR.puro和pEGFP-N1質粒共轉染,用熒光顯微鏡觀察細胞中GFP的表達檢測轉染效率,轉染成功的細胞存在GFP表達,結果如圖1所示.由圖1可見,共轉染組細胞中存在顯著的GFP表達,轉染效率約為45%.

(A) 空載體轉染組明場；(B) 空載體轉染組暗場；(C) pSUPERIOR.puro和pEGFP-N1質粒共轉染組明場；(D) pSUPERIOR.puro和pEGFP-N1質粒共轉染組暗場.圖1 pSUPER-HER2/neu-shRNA的轉染效率Fig.1 Transfection efficiency of pSUPER-HER2/neu-shRNA

2.3 HER2/neu-shRNA重組質粒對HER2/neu mRNA表達的影響

各組質粒轉染24 h后,熒光實時定量PCR檢測HER2/neumRNA表達情況,引物序列列于表2.結果顯示,轉染陰性對照質粒組HER2/neumRNA表達量約為空載體轉染組的(90.58±5.26)%,t檢驗顯示差異較小.轉染HER2/neu-shRNA-1～HER2/neu-shRNA-3質粒組分別為空載體轉染組的(15.35±3.02)%,(53.8±15.06)%和(76.86±3.11)%,t檢驗顯示差異較大.其中HER2/neu-shRNA-1對HER2/neu基因表達水平抑制作用最大,如圖2所示.

表2 實時PCR引物Table 2 Primers for real-time PCR

2.4 HER2/neu-shRNA對HER2/neu蛋白的影響

HER2/neu蛋白分子量為185 000,用Western blot法檢測RNAi對蛋白的影響,結果如圖3所示.由圖3可見,以空載體轉染組作為空白對照,陰性對照組蛋白相對表達量約為(93.94±4.27)%,差異較小.HER2/neu-shRNA-1,HER2/neu-shRNA-2和HER2/neu-shRNA-3質粒轉染組HER2/neu蛋白相對表達量分別為空載體轉染組的(26.02±3.62)%,(69.31±2.03)%和(78.09±5.29)%,均遠低于空白和陰性對照組(P<0.05),其中HER2/neu-shRNA-1質粒轉染組目的蛋白的表達水平最低.

1.空載體轉染組；2.HER2/neu-shRNA-C陰性對照轉染組；3.HER2/neu-shRNA-1轉染組；4.HER2/neu-shRNA-2轉染組；5.HER2/neu-shRNA-3轉染組.圖2 轉染HER2/neu-shRNA 24 h后HER2/neu mRNA的表達Fig.2 Expression of HER2/neu mRNA after transfection with HER2/neu-shRNA for 24 h

1.空載體轉染組；2.HER2/neu-shRNA-C陰性對照轉染組；3.HER2/neu-shRNA-1轉染組；4.HER2/neu-shRNA-2轉染組；5.HER2/neu-shRNA-3轉染組.圖3 轉染HER2/neu-shRNA 48 h后HER2/neu蛋白的表達Fig.3 Expression of HER2/neu protein after transfection with HER2/neu-shRNA for 48 h

2.5 HER2/neu-shRNA重組質粒對SK-BR-3細胞遷移的影響

通過劃痕實驗研究HER2/neu-shRNA重組質粒對SK-BR-3細胞遷移的影響,結果如圖4所示.由圖4可見,空載體轉染組和陰性重組質粒轉染組細胞遷移明顯.各重組質粒轉染組細胞遷移能力均不同程度地受到抑制,其中HER2/neu-shRNA-1轉染組對SK-BR-3細胞遷移抑制最大.這是由于本文構建的干擾質粒可有效抑制HER2/neu蛋白,進而抑制SK-BR-3細胞遷移所致.

1.空載體轉染組；2.HER2/neu-shRNA-C陰性對照轉染組；3.HER2/neu-shRNA-1轉染組；4.HER2/neu-shRNA-2轉染組；5.HER2/neu-shRNA-3轉染組.圖4 轉染HER2/neu-shRNA 48 h后SK-BR-3細胞的遷移Fig.4 Migration of SK-BR-3 after transfection with HER2/neu-shRNA for 48 h

綜上,本文以HER2/neumRNA序列中的3段核苷酸為靶點,設計了3個shRNA干擾序列,先將其克隆至pSUPERIOR.puro質粒上,再將重組的真核表達質粒轉染至人乳腺癌細胞SK-BR-3中,通過熒光實時定量PCR、蛋白免疫印跡和劃痕實驗檢測干擾效果.結果表明,本文設計的shRNAs均可不同程度下調HER2/neumRNA和蛋白水平,從而抑制SK-BR-3遷移,達到基因治療的目的.其中以質粒HER2/neu-shRNA-1的作用效果最強.

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