虎杖灌胃大鼠血尿中蒽醌類代謝物的LC-MS分析

康 威,沈詠梅,鄧巧虹,余輝攀,林青華,張宏桂

(1.北京中醫藥大學 中藥學院,北京 100102;2.吉林大學 白求恩醫科大學制藥廠,長春 130012)

中藥虎杖系蓼科蓼屬植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根莖和根[1],具有祛風利濕、散瘀定痛和止咳化痰的功效,主要含有蒽醌類化合物.目前已有的研究均利用高效液相色譜(HPLC)法測定血清或血漿等生物樣品中的蒽醌類成分,由于代謝物成分較復雜,因此干擾較多[2].液相色譜-電噴霧串聯質譜(LC-MS)方法多用于單一成分試藥的代謝產物鑒定[3-4],本文以中藥樣品中蒽醌類代謝物的LC-MS分析為例,探討復雜樣品中某一成分代謝產物結構是否因多成分共存而改變,并建立LC-MS法測定大鼠灌胃虎杖提取物后的血漿和尿液中主要代謝產物的方法.

1 實 驗

1.1 儀器與藥品

Agilent 1100系列液質聯用儀；Agilent LC/MSD Trap XCT Plus型質譜;二極管陣列檢測器;高壓二元梯度泵;自動進樣器;ChemStations工作站.

大黃素甲醚、大黃酚大黃素和蘆薈大黃素購自中國食品藥品檢定研究院；色譜級甲醇；水為二次蒸餾水并經0.45 μm濾膜過濾;虎杖提取物為自制;Wistar大鼠由北京中醫藥大學實驗動物中心提供.

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18(4.6mm×250 mm,5 μm),柱溫為室溫(25 ℃)；流動相見表1；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL.

表1 甲醇-水線性梯度洗脫流動相Table 1 Linear gradient elution mobile phase of methanol-water

1.2.2 質譜條件 電噴霧離子源,離子源溫度350 ℃,毛細管電壓3.5 kV,霧化壓力275.8 kPa,干燥氮氣流速10 L/min,質譜掃描范圍m/z50～750,負離子檢出模式.

1.2.3 化學對照品溶液配置 稱取適量大黃酚、大黃素甲醚、大黃素和蘆薈大黃素對照品,置于50 mL 量瓶中,用甲醇定容,搖勻,得上述4種標準品的混合液.

1.2.4 大鼠血漿樣品的采集及處理 取健康雄性Wistar大鼠6只,平均210 g,置于代謝籠中,給藥前禁食,可自由飲水12 h.用虎杖提取物水溶液灌胃,給藥劑量為200 mg/kg.大鼠灌胃后,分別于1,3,6,12,24 h由大鼠眼底靜脈叢取血,置于1 mL肝素化的離心管中,以3 000 r/min離心10 min,取上清液即得血漿樣品.用甲醇和水各3 mL依次活化Cleanert C18SPE固相萃取柱,上樣3 mL,用2 mL水洗脫,再用2 mL甲醇洗脫,甲醇液經0.45 μm濾膜過濾后用于LC-MS分析.

1.2.5 大鼠尿液的采集與處理 取健康雄性Wistar大鼠6只,給藥前禁食,可自由飲水12 h.取虎杖提取物,用質量分數為0.5%的羧甲基纖維素鈉制成混懸液,按200 mg/kg灌胃給藥,分別收集1,3,6,12,24 h的尿液.尿液經0.45 μm濾膜過濾后萃取.用甲醇和水各3 mL依次活化Cleanert C18 SPE固相萃取柱,上樣3 mL,用2 mL水洗脫,再用2 mL甲醇洗脫,甲醇液用于LC-MS分析.

2 結 果

2.1 血漿樣品中蒽醌代謝產物的結構分析

6 h血漿樣品經LC-MS測定所得總離子流如圖1所示.分析圖1中的峰1可得其MS2碎片離子如圖2所示.由圖2可見,其一級譜的基峰m/z269[M-H],并出現強峰m/z187和弱峰m/z225.與大黃素HPLC保留時間(46 min)及其質譜碎片離子比較[2],鑒定其為大黃素.

24 h血漿樣品經LC-MS測定所得總離子流如圖3所示.分析圖3中的峰2可得其MS2碎片離子如圖4所示.由圖4可見,其一級質譜基峰為m/z253[M-H],并出現強峰m/z187和弱峰m/z87.與大黃酚HPLC保留時間(48 min)及其質譜碎片離子比較[2],鑒定其為大黃酚.分析圖3中的峰3可得其MS2碎片離子如圖5所示.由圖5可見,其一級質譜基峰為m/z283[M-H],并出現較強峰m/z175和m/z113.與大黃素甲醚的HPLC保留時間(53 min)及其質譜碎片離子比較[5],鑒定其為大黃素甲醚.

圖1 6 h血漿樣品總離子流Fig.1 Total ion chromatogram of the plasma sample collected at 6 h after the last administration

圖2 圖1中峰1的MS2碎片離子Fig.2 MS2 of the fraction of peak 1 from Fig.1

圖3 24 h血漿樣品總離子流Fig.3 Total ion chromatogram of the plasma sample collected at 24 h after the last administration

圖4 圖3中峰2的碎片離子Fig.4 MS2 of the fraction of peak 2 from Fig.3

圖5 圖3中峰3的碎片離子Fig.5 MS2 of the fraction of peak 3 from Fig.3

2.2 尿液試樣蒽醌代謝產物結構分析

對尿液樣品進行LC-MS檢測,共檢測到4種代謝產物,其碎片離子如圖6所示.

(A) 大黃素葡萄糖醛酸結合物一級質譜;(B) 大黃素葡萄糖醛酸結合物二級質譜;(C) 大黃素質譜;

由圖6可見: 第一種蒽醌代謝產物的準分子離子峰m/z為445,比m/z269增加了176個質量單位,具有典型的葡萄糖醛酸化代謝途徑的質譜特征[6],因此推測該蒽醌代謝產物為大黃素的葡萄糖醛酸結合物;第二種蒽醌代謝產物的分子量為270,與對照品比較鑒定為大黃素[5];第三種蒽醌代謝產物準分子離子峰m/z為365,與對照品蘆薈大黃素結構碎片比較,判斷該代謝產物可能為蘆薈大黃素的磺酸化結合物[6];第四種代謝產物準分子離子峰的m/z為462,推斷其可能為蘆薈大黃素的葡萄糖醛酸結合物[6].

3 討 論

1) 在虎杖提取物以多種成分給藥的條件下,本文鑒定的蒽醌類化合物與單一蒽醌化合物給藥具有相同的代謝產物[6],表明虎杖提取物其他成分對這些蒽醌化合物在大鼠體內的代謝未構成干擾；

2) 虎杖蒽醌類提取物在大鼠體內的代謝產物主要以大黃素原形物和葡萄糖醛酸結合物及硫酸酯綴合物的形式存在;

3) 利用本文方法對血漿和尿液中的代謝產物進行檢測時,質譜可給出較多的碎片離子,有利于確定代謝產物的結構.

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