HPLC法測定復方芩蒼鼻噴霧劑中黃芩苷的含量

韓憲忠，金蜀蓉，柯昌毅，謝劍鋒（重慶市第三人民醫院，重慶 400014）

鼻炎是發生在鼻腔黏膜的炎性疾病，為耳鼻喉科常見病、多發病。其臨床癥狀主要表現為鼻內發癢、打噴嚏、流清鼻涕、鼻堵塞等，嚴重影響患者的生活質量[1]。古方“蒼耳散”具有散風祛濕、通九竅、抗菌等作用，治療鼻炎效果顯著[2]。筆者根據臨床需要，結合現代中醫藥理論，參考古方“蒼耳散”與“鼻康合劑”處方并進行加減，重新組方并精制成了復方芩蒼鼻噴霧劑。為保證該制劑的質量，本試驗建立了復方芩蒼鼻噴霧劑中黃芩苷的含量測定方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜（HPLC）儀，含1525二元泵、2487雙波長紫外檢測器、717自動進樣器、Breeze色譜工作站（美國Waters公司）；AR1140電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

復方芩蒼鼻噴霧劑（重慶市第三人民醫院自制，批號：110112、110113、110119）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-200815）；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。試驗前所有液體試劑均經0.45 μ m微孔濾膜濾過。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：20℃；進樣量：10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷對照品3.10 mg，置于10 ml量瓶中，用少量甲醇經超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得310 μg/ml的對照品貯備液。再精密量取該貯備液2 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得62 μg/ml的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品2 ml，置于100 ml量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

以相同處方比例的空白輔料制得空白樣品，照“2.3”項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.5 系統適用性試驗

取“2.2”項下對照品貯備液，按“2.1”項下色譜條件進樣10 μl，記錄色譜圖。結果，理論板數按黃芩苷峰計算應為4564，表明柱效良好。

2.6 檢測波長的選擇

參照2010年版《中國藥典》（一部）黃芩藥材的含量測定方法，選擇280 nm為檢測波長。

2.7 專屬性試驗

取上述對照品、供試品、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件注入HPLC儀，繪制色譜圖。結果顯示，陰性對照在與黃芩苷對照品色譜圖相應位置上未見干擾；供試品在與對照品色譜圖相應保留時間位置上有相應的色譜峰，并且與相鄰峰有較好的分離。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.8 線性關系考察

分別精密量取質量濃度為310 μg/ml的黃芩苷對照品貯備液0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0ml，置于10ml量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為 6.2、31.0、62.0、124.0、310.0μg/ml的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣10 μl，測定峰面積。以黃芩苷進樣量（x）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝40248 x－72915（r＝0.9993，n＝6）。結果表明，黃芩苷的質量濃度在6.2～310.0 μ g/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.9 精密度試驗

精密吸取黃芩苷對照品溶液（62 μg/ml）連續進樣6次，每次10 μl，記錄色譜圖。結果，RSD＝1.04%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.10 重復性試驗

精密量取同一批樣品2 ml，共6份，分別置100 ml量瓶中，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按擬定方法進行含量測定。結果，樣品中黃芩苷的平均質量濃度為24.60μg/ml，RSD＝1.69%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.11 穩定性試驗

精密量取同一供試品溶液適量，分別于0、4、8、16、24 h時按擬定方法進樣測定。結果，RSD＝0.56%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.12 加樣回收率試驗

取已知黃芩苷含量的同一批樣品0.1 ml，共9份，每3份為一組，分別按低、中、高質量濃度精密加入黃芩苷對照品貯備液各適量，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按擬定方法測定含量，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.13 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別照“2.3”項下方法制備供試品溶液，各取10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別進樣3次，記錄色譜圖，并以外標法計算樣品中黃芩苷的質量濃度，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

3 討論

HPLC法分離效能高、分析速度快、應用范圍廣，其重現性和準確度均優于薄層色譜掃描法，現已作為中藥及其制劑的常規含量測定方法[3]。黃芩苷為含羥基的黃酮類化合物[4]，極性較大。筆者通過對文獻報道的多種流動相進行試驗，并參考2010年版《中國藥典》[5]，以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）為流動相，其中磷酸可作為解離抑制劑，抑制組分解離，增強保留[6]。該條件下黃芩苷峰與相鄰峰能較好的分離，對稱性好，故選用此流動相。

試驗中發現，溫度對黃芩苷的保留時間有一定影響：當溫度在20℃左右時，黃芩苷的保留時間在10.2 min左右；當溫度在30℃左右的時候，黃芩苷的保留時間會降至7.6 min左右。Yang Y等[7]發現隨著柱溫的升高，極性和非極性物質的保留因子都減小。因此，為了保證色譜峰出峰時間的一致性，如沒有溫箱，應盡量保證柱溫的相對一致性，以減少由于溫差造成保留時間的較大變化。

試驗結果表明，本方法簡便、快速、準確、重復性好，可用于復方芩蒼鼻噴霧劑中黃芩苷的含量測定和該制劑的質量控制。

[1]張羅，韓德明，王琪，等.鼻炎概述[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2007，14（1）：19.

[2]李宏偉.辛夷蒼耳散加減治療急慢性鼻竇208例觀察[J].中國社區醫師，2010，13（12）：123.

[3]黃其春，徐文升.HPLC法測定痰熱清注射液中黃芩苷的含量[J].中國藥房，2008，19（30）：2388.

[4]江紀武，肖慶祥.植物有效成分手冊[M].北京：人民衛生出版社，1986：111.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：391.

[6]李發美.分析化學[M].6版.北京：人民衛生出版社，2008：398.

[7]Yang Y，Jones AD，Eaton CD.Reerention behavior of phenols，anilines，and alkylbensenes in liquid chromatographic separations using subcritical water as the mobile phase[J].Anal Chem，1999，71（17）：3808.