Nodosin在水中的平衡溶解度和穩定性研究Δ

尚校軍，馬素英，邵芃，閆福林#（.新鄉醫學院藥學院，河南新鄉453003；.新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉 453003）

Nodosin是從香茶菜屬植物溪黃草中分離出的一種二萜類化合物，體外活性研究顯示其具有明顯的抗癌活性[1-3]。但對nodosin在水中的溶解度以及在水溶液中穩定性的研究很少，為此，筆者進行了上述內容的研究，為nodosin藥物劑型研發提供試驗數據。

1 材料

1.1 儀器

LC-6 AD高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；pHS-3 TC數顯pH計（上海天達儀器有限公司）；BS224 S電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇佳美儀器有限公司）；CH1015超級恒溫水槽（上海衡平儀器儀表廠）。

1.2 試劑

nodosin對照品（新鄉醫學院藥學院天然藥物化學教研室自制，純度＞98.0%）；甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 nodosin含量測定方法[4]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Sion Chrom ODS-bp（200mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40，V/V）；檢測波長：231 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：38℃。在此色譜條件下，nodosin的保留時間約為5.45 min。色譜見圖1 A。

2.1.2 標準曲線的制備 精密稱定用五氧化二磷干燥至恒質量的nodosin對照品19.8 mg，置于25 ml量瓶中，加流動相溶解并定容，制成nodosin質量濃度為792 μg/ml的貯備液。分別精密量取此貯備液50、100、500、1000、1500、2000μL，置于10 ml量瓶中，加流動相制成nodosin質量濃度分別為3.96、7.92、39.60、79.20、118.80、158.40 μg/ml的溶液，分別取上述溶液20 μL，按上述色譜條件測定。以藥物質量濃度（c）對峰面積積分值（A）進行線性回歸，得回歸方程為c＝0.0519 A+0.0599（r＝0.9998，n＝6）。結果表明，nodosin質量濃度在3.96～158.40 μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2 平衡溶解度的測定

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

稱取過量nodosin，置于10 ml具塞玻璃試管中，精密加入蒸餾水3 ml，將試管放在（25±0.5）℃恒溫水浴振蕩器中振搖12 h，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液經適當稀釋后，取樣20 μL，按上述色譜條件測定nodosin的質量濃度，并計算溶液中nodosin的平衡溶解度。結果，25℃下，nodosin在水中平衡溶解度為38.33 mg/L。根據《中國藥典》規定，nodosin屬于不溶性藥物。

2.3 nodosin水溶液穩定性考察

2.3.1 樣品溶液的制備 精密稱取nodosin 6.5mg，置于200 ml量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，得32.5μg/ml的nodosin樣品溶液。

2.3.2 經典恒溫法預測藥物水溶液在室溫下的穩定性 精密量取樣品溶液15 ml，置于具塞玻璃試管中，密封。分別在40、50、60、70、80℃恒溫水浴中避光保存30 h，分別于0、2、6、12、24、30 h各取樣0.5 ml，取樣20 μl，按上述色譜條件測定nodosin的質量濃度，并繪制藥物降解曲線。30 h，80℃nodosin水溶液的HPLC見圖1 B；不同溫度下nodosin水溶液的降解曲線見圖2。

圖2 不同溫度下nodosin水溶液的降解曲線Fig 2 Degradation curves of nodosin solution at different temperatures

由圖2可知，nodosin在水中的降解隨著溫度的升高而加快。將其在不同溫度下的降解數據分別代入零級、一級和二級反應方程進行擬合，詳見表1。

表1 不同溫度下nodosin的降解擬合方程Tab 1 Fitted equation of nodosin degradation at different temperatures

由表1可知，零級、一級、二級反應方程擬合結果都可接受。綜合評價，一級反應方程擬合效果最好，并且一級反應的速率常數（K）與藥物質量濃度無關，適用范圍廣，因此選用一級反應方程計算nodosin水溶液降解的K。

表2 nodosin水溶液在25、4℃下反應速率相關參數Tab 2 Related parameter of reaction rate of nodosin solution at 25、4℃

圖3 nodosin水溶液的Arrhenius圖Fig 3 Arrhenius map of nodosin solution

由表2可知，nodosin水溶液在25℃下的t90為190.22 h，在4℃下t90為2299.37 h。

2.3.3 pH值對nodosin水溶液穩定性的影響 精密量取“2.3.1”項下樣品溶液8 ml，分別用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液調樣品溶液pH值分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，再用同樣pH值的空白溶液定容至10 ml，搖勻密封，在室溫下避光放置30 h，分別于0、2、6、12、24、30 h各取樣0.5 ml，經過適當稀釋，取樣20μl，按上述色譜條件測定nodosin質量濃度。根據一級反應方程，分別計算各pH值下nodosin的降解K，以lgK對pH值作圖，繪制pH-速率曲線，考察pH值對藥物穩定性的影響。結果，nodosin水溶液降解的pH-速率曲線呈V型，根據曲線的走向趨勢，nodosin在酸性條件下比在堿性條件下穩定，當pH值在5～7范圍內時，溶液最穩定。故可以判斷，nodosin水溶液的降解受溶液pH值影響，屬于酸堿催化反應。nodosin在30 h，pH 1.0溶液和12 h，pH 11.0溶液中的HPLC分別見圖1中C、D；nodosin水溶液降解的pH-速率曲線見圖4。

圖4 nodosin水溶液降解的pH-速率曲線Fig 4 pH-degradation rate curves of nodosin solution

3 討論

藥物穩定性考察是處方前研究的重要組成部分，對選擇合理劑型和制劑工藝具有重要指導意義。

本試驗研究顯示，nodosin在水中溶解度較小，水溶液也不穩定，而且隨著溫度升高，降解加速。25℃室溫下，nodosin的有效期t90僅為190.22 h，4℃下t90為2299.37 h。

nodosin的穩定性還受環境中酸、堿性的影響，屬于酸堿催化的降解反應，尤其在堿性環境中，降解速度比酸性環境快，在pH 5～7范圍內的中性偏酸環境中，較為穩定。因此，對于nodosin的血管外給藥制劑適宜選擇固體劑型，靜脈給藥制劑適宜制成注射用無菌粉末，并且制備過程中還要注意溶液受pH值和溫度的影響。

[1]Yan FL，Wang CM，Guo LQ，et al.A new ent-kaurane diterpenoid from Isodon nervosus[J].J Chem Research，2008，2008（9）：522.

[2]海廣范，閆琰，劉巨源，等.Enmein、serrinB、nodosin和lasiodonion對HL60細胞株和lovo細胞株的增殖抑制作用[J].新鄉醫學院學報，2008，25（6）：564.

[3]He F，Xiao WL，Pu JX，et al.Cytotoxic ent-kaurane diterpenoids from Isodon sinuolata[J].Phytochemistry，2009，70：1462.

[4]倪林，李樹華，盧海嘯，等.HPLC法測定顯脈香茶菜中Nodosin的含量[J].廣東藥學院學報，2010，26（6）：605.