HPLC-熒光法測定坎地沙坦血藥濃度及坎地沙坦酯制劑的生物等效性研究

張樂，周世文，徐穎，應懿，黃永平，湯建林（第三軍醫大學新橋醫院臨床藥理基地，重慶400037）

坎地沙坦酯是一種血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體AT1亞型拮抗藥，在化學結構上與氯沙坦、伊貝沙坦相似，同屬二苯四咪唑類。它可選擇性地阻滯由AT1受體所介導的AngⅡ功能（如血管收縮和醛固酮分泌），從而發揮降壓作用。其與AT1受體的親和力是AT2受體的10000倍，具有親和力強和解離慢的特點。臨床研究表明，每日給予高血壓患者本品4～16 mg，其降壓作用呈劑量依賴性，降壓效果優于氯沙坦50 mg。坎地沙坦酯口服后迅速從胃腸道吸收，并水解成具有活性的代謝產物坎地沙坦產生血管收縮對抗作用。食物對本品吸收沒有影響，重復給藥無蓄積作用。由于坎地沙坦酯血漿中藥物含量低且內源性物質干擾大，采用常規的高效液相色譜（HPLC）-紫外測方法難以達到所需的檢測靈敏度[1]。本試驗根據藥物的理化性質及國內外文獻[1]，設計建立了高效液相色譜-熒光法，用于坎地沙坦的測定，并對坎地沙坦酯制劑進行人體生物等效性研究。

1 材料

1.1 儀器

Waters-600 E型高效液相色譜系統，配2475型熒光檢測器，717 plus型自動進樣器及Millennium32色譜管理軟件（美國Waters公司）；MC-210 S型電子天平（精度0.01 mg，德國Sartorius公司）；高速離心機（美國Abbott公司）；Millipore超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

受試制劑（T）：坎地沙坦酯膠囊（重慶市西曦藥物技術開發有限公司生產，每粒含坎地沙坦酯4 mg，批號：061001）；參比制劑（R）：坎地沙坦酯片（商品名：必洛斯，日本武田藥品工業株式會社生產，重慶市西曦藥物技術開發有限公司提供，每片含坎地沙坦酯8 mg，批號：060601）；坎地沙坦對照品（重慶圣華曦制藥有限公司，純度：99.5%）；內標：纈沙坦對照品（重慶圣華曦制藥有限公司，純度：99.0%）；三乙胺（德國Fluka公司，純度≥99.5%）；乙醚、甲醇均為色譜純，磷酸等其他試劑均為分析純，試驗用水均為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；保護柱：C18柱芯（4.0 mm×3.0 mm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（66∶34，V/V，磷酸調pH至4.0）；流速：1 ml/min；激發波長：265 nm，發射波長：395 nm；柱溫：30℃。在選定的色譜條件下，分別考察了7個不同來源的空白血漿、空白血漿+對照品及實測樣品的色譜分離情況。結果表明，被測物、內標與血漿內源性雜質分離完全，無干擾。坎地沙坦和內標峰的保留時間分別為5.9、8.9 min。測得坎地沙坦色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 標準溶液的配制

2.2.1 坎地沙坦標準溶液：準確稱取坎地沙坦對照品5.38 mg于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質量濃度為107.6 μg/ml的對照品貯備液，于4℃避光保存。臨用前，精密吸取該貯備液4 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成43.04μg/ml的坎地沙坦標準溶液，于4℃避光保存，備用。

2.2.2 內標溶液：準確稱取纈沙坦對照品5.13 mg于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質量濃度為51.3 μg/ml的內標貯備液，4℃保存。臨用前，取內標貯備液1 ml于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成5.13 μg/ml的內標溶液備用。

2.3 血漿樣品預處理

取血漿1 ml加入內標溶液（5.13 μg/ml纈沙坦）50 μl，混合均勻后，加入1 mol/L鹽酸200 μl，渦旋混合3 min，加入乙醚5 ml提取，完全旋渦，3000 r/min離心10 min，取乙醚層置于另一試管中，37℃氮氣吹干，殘留物加入流動相300 μl溶解，旋渦混合1 min，4000 r/min離心20 min，取上清液100 μl進樣。

2.4 標準曲線的制備

取空白血漿1 ml依次加入內標溶液（5.13 μg/ml纈沙坦）50 μl和不同濃度系列標準溶液50 μl，配制成相當于坎地沙坦血漿質量濃度為 0.98、1.95、3.91、7.81、15.62、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/ml的血漿標準樣品。按“2.3”項下依法操作，每一濃度進樣100 μl，記錄色譜圖，以質量濃度（x）為橫坐標，藥物與內標峰面積之比（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y＝－6.32×10－3x+1.03×10－2（r＝0.9997）。說明坎地沙坦血藥濃度在0.98～500.00 ng/ml范圍內線性關系良好。血漿中坎地沙坦定量下限為0.98 ng/m（l信噪比為5，x ＝1.11 ng/ml，RSD＝11.5%，n＝5）。

2.5 精密度試驗

取空白血漿1 ml，按“2.4”項下方法配制低、中、高3個質量濃度的血漿樣品各5份，按“2.3”項下依法操作，于同一天不同時間段測定，考察日內精密度。3個質量濃度的血漿樣品各5份，連續測定3 d，考察日間精密度，結果見表1。

2.6 回收率試驗

表1 精密度及回收率試驗結果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.6.1 相對回收率：取空白血漿1 ml，按“2.4”項下的方法制備低、中、高3個質量濃度（坎地沙坦血漿濃度分別為1.95、31.25、250 ng/ml）的樣品各5份并依法測定。將藥物與內標峰面積之比代入標準曲線求得藥物濃度，其與實際藥物濃度的比值即為相對回收率，結果見表1。

2.6.2 絕對回收率：取空白血漿1 ml，按“2.4”項下的方法制備低、中、高3個質量濃度（坎地沙坦血漿濃度分別為1.95、31.25、250 ng/ml）的樣品各5份并依法測定。以提取后待測物色譜峰面積與相同濃度未經提取直接進樣獲得的色譜峰面積之比，計算樣品的絕對回收率，結果見表1。

2.7 穩定性試驗

本試驗考察了未經處理的坎地沙坦血漿樣品室溫放置24 h，－20℃冷凍放置21 d及凍融3次的穩定性，結果見表2。

表2 穩定性試驗結果Tab 2 Results of stability test

2.8 血樣采集

根據國家藥品監督管理局新藥臨床研究批件（2003 L00047），經院倫理委員會批準，20名健康男性受試者在知情情況下填寫知情同意書，并實施試驗。20名健康受試者口服8 mg受試制劑或參比制劑后，分別采集服藥前及服藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h時的靜脈血約4 ml肝素抗凝，分離得到血漿于，－20℃冰箱保存，待測血藥濃度。

2.9 藥動學參數

用BECS軟件程序對經對數換后的AUC0-t、AUC0-∞、cmax和實測tmax進行統計分析。方差分析后進行雙單側t檢驗及90%的可信限判斷，坎地沙坦酯膠囊經對數轉換后AUC0-t、AUC0-∞的90%可信限分別落在參比制劑的80.4%～107.3%和80.2%～107.0%范圍內。經對數轉換后cmax的90%可信限落在參比制劑的80.1%～111.6%范圍內。tmax經非參數檢驗無顯著性差異。由此判斷2種制劑生物等效。20名受試者單劑量口服8 mg受試制劑或參比制劑后的平均藥-時曲線見圖2。

圖2 20名健康受試者分別口服受試制劑和參比制劑后坎地沙坦藥-時曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves in 20healthy volunteers of test and reference candesartan preparations

3 討論

在摸索流動相體系的過程中，我們考察了流動相中甲醇的不同體積分數（70%、66%、60%）及流動相的不同pH值（5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5）對分析結果的影響，通過比較，選擇本流動相效果最佳。在此條件下，雜質峰對樣品峰干擾小，保留時間適宜，坎地沙坦和內標纈沙坦保留時間分別為5.9 min和8.9 min，與文獻報道相比均有所提前，既節省進樣時間又節省試驗經費。樣品處理時考慮到操作的方便性，采用鹽酸沉淀蛋白后直接用乙醚提取，坎地沙坦提取回收率較高，且不受內源性物質的干擾，同時還提高了測定靈敏度，定量下限為0.98ng/ml。試驗結果表明，本法可用于該藥的血漿含量測定及制劑的生物等效性研究。

[1]Stenhoff H，Per-Olof lagerstr?m，Andersen C.Determination of candesartan cilexetil，candesartan and a metabolite in human plasma and urine by liquid chromatography and fluorometric detection[J].Journal of Chromatography B，1999，731（9）：411.