天花粉蛋白對HeLa細胞抑制作用的實驗研究

謝博超

（南華大學附屬第一醫院婦產科 湖南 衡陽 421001）

天花粉蛋白（Triehosanthin，TCS）是從葫蘆科植物栝樓（一chosanthin kirilouii Maxim）的塊根中提取出來的一種單鏈核糖體失活蛋白（ribosome－indctivating protein，RIP），具有多種生物學效應，主要包括免疫凋節、抗腫瘤、抗病毒等作用。目前，TCS的抗腫瘤研究主要集中在絨毛膜上皮癌、胃腸道腫瘤和白血病等方面。本實驗研究TCS 對人宮頸癌HeLa細胞生長的抑制作用，并從誘導細胞凋亡的角度探討其抗癌作用，探討TCS抗宮頸癌作用及其機制。

1 準備材料及實驗方法

1．1 藥品及試劑：TCS購自上海金山制藥有限公司（1．2g／L），培養基DMEM（GBICO 公司），新生牛血清FBS（四季青），碘化丙啶（PI）及RNA 酶（Simga公司產品），組織基因組DNA 提取試劑盒及DNA Ladder（北京天根生化科技有限公司），DNA 甲基化試劑盒（北京天漠科技開發有限公司），Taq DNA 聚合酶及dNTPMix（Amresco公司）。電泳儀（－C Apparatus Corpora．tion產品），微型凝膠電泳系統（Bio－Rad產品），DY－Ⅲ電泳槽（北京六一儀器廠產品），凝膠成像系統分析儀（上海天能科技有限公司產品）。

1．2 細胞來源及培養：HeLa（人宮頸癌）細胞（為本實驗室保存細胞株）。將細胞培養于37℃，5%CO2的濕化細胞培養孵箱中。培養基DMEM 含10%FBS，0．1U／L青霉素，0．1U／L鏈霉素，取對數生長期細胞待用。

1．3 HeLa細胞生長抑制實驗：本實驗采用噻唑藍（MTT）還原法進行：取對數生長期HeLa細胞，用96孔培養板中進行接種（每孔的培養基細胞數為4000個），待培養24h細胞貼壁后，對照組換新鮮培養基。實驗組培養基加不同濃度TCS，使終濃度分別為10、20、40、80、160mg／L，置入CO：加入MTT，培養箱內分別培養24，48，72h后，將上清去除每孔加入150DMSO，然后將培養板置于微孔板振蕩器上輕度振蕩10min，在酶標儀上測定570nm 處光吸收值（OD 值）。取8孔吸收值平均數，按公式細胞抑制率（%）＝（1－實驗組平均吸光度值／對照組平均吸光度值）×100% 計算藥物對細胞生長的抑制作用。

1．4 細胞周期觀察及凋亡檢測

1．4．1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳胰蛋白酶消化收獲實驗組及對照細胞：l000r／min離心5min，PBS清洗細胞兩遍，NP－40 溶液作用細胞沉淀，加入SDS（終濃度l%）及RNase，56℃處理2h，蛋白酶K37℃作用3－5h，加入1／10體積的3M 醋酸鈉及2倍體積的無水乙醇，輕輕振搖后置于一70℃冰箱中過夜，14 000r／min離心15min，將上清去除，用冰冷的70%乙醇漂洗，1．2% 瓊脂糖凝膠電泳3－5h，紫外燈下觀察并成像。

1．4．2 流式細胞儀檢測分別離心收集對照組及實驗組細胞：以含0．2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定，在10000r／min條件下離心5min，去乙醇，PBS洗滌兩次，將上清去除；加入等體積的細胞裂解緩沖液室溫作用下5min，加Rnase A 置37℃水浴中消化30min，離心后再加人1ml PI染色避光染色30min。

1．4．3 取不同濃度TCS（20、40和80 mg／L）分別作用對數生長期HeLa細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀測定熒光強度，激發波長488 nm，采用Modfit分析軟件進行細胞周期DNA 含量分析及細胞凋亡率檢測。

1．5 統計學方法：數據應用SPSS10．0軟件包進行統計學分析，計量資料組間比較采用t檢驗，計量資料以（x±s）表示，細胞周期與凋亡率組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD和SNK 檢驗。

2 結果

2．1 MTT 法測定TCS對HeLa細胞生長的抑制作用，見表1。

20，40和80mg／l的天花粉蛋白分別作用于Hela細胞后，隨著作用時間的延長，細胞的生長抑制率逐漸升高，且抑制率隨藥物濃度增加而上升，呈一定的劑量、時效依賴性。見表1。

2．2 TCS對HeLa細胞凋亡率的影響：分析TCS作用HeLa細胞48 h后細胞凋亡率的變化，三種TCS濃度作用后分別與對照組比較細胞凋亡率顯著增高（P＜0．01）。三種濃度之間比較亦有顯著差異（P＜0．01）。由分析數據可得，隨著天花粉蛋白藥物濃度的增大及作用時間的延長，凋亡細胞的比例增加，表明TCS誘導Hela細胞凋亡具有時間和劑量依賴性。（見表2）

表1 TCS（不同濃度）對HeLa細胞的抑制率

表2 凋亡細胞在各組中的百分比變化及TCS（不同濃度）對HeLa細胞凋亡率的影響

2．3 TCS對HeLa細胞DNA 斷裂的影響：經凝膠電泳分析出TCS（不同濃度）對HeLa細胞DNA 的影響，發現其出現斷裂的狀況，呈現出HeLa細胞凋亡的梯級格局。見圖1；對照組的細胞DNA 無斷裂現象出現（見圖2）。

3 討論

經本文研究發現，TCS對HeLa細胞增殖有明顯抑制作用，呈量效關系。天花粉蛋白是從中草藥天花粉（栝樓塊根）中分離得到的一種Ⅰ型核糖體失活蛋白質，TCS為247個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，TCS屬于RNAN 一糖苷酶型，專一水解核糖體28SrRNA 第4324位腺苷酸的NC糖苷鍵，從而引起核糖體某些區域構象的改變，影響核糖體的生物學功能，從而發揮腫瘤抑制作用。隨著天花粉蛋白的深入研究和應用范圍的拓展，其藥物開發價值13益引起廣泛關注。科研人員對鮮藥材植物栝樓的種植，藥物的采集、提取、分離純化以及進一步加工和分子克隆等，都進行了相關研究。當前，作為商品化的天花粉蛋白已在臨床使用。商品天花粉蛋白主要從鮮植物體中提取，部分利用分子克隆技術體外表達，但在這些過程中蛋白活力會受到不同程度的影響，其藥物效力也將隨之改變。

細胞增殖失控和凋亡受阻是腫瘤發生、發展的主要原因，抑制細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的重要手段之一。TCS能誘導HeLa細胞凋亡，且TCS濃度與凋亡率之間存在量效關系。有研究表明，天花粉蛋白具有核酸內切酶功能，能夠切割細胞DNA 超螺旋結構，導致細胞損傷。另外，TCS可能通過與受體結合，引起細胞內信號途徑的激活或抑制，從而導致細胞凋亡。

細胞凋亡是細胞生長發育過程中發生的一種極其復雜的生理變化過程，經研究發現腫瘤的發生與細胞凋亡的紊亂調節性密切相關。有很多資料發現，很多的抗癌藥物都是通過最終觸發腫瘤細胞凋亡從而達到治療的目的，所以有效的誘其腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的新方法之一。天花粉蛋白是一種新型的有效的專一的抗腫瘤藥物，與一般的化療藥物不同，一般的化療藥物會造成腫瘤和正常細胞全部凋亡，TCS對人的外周血淋巴細胞、T 細胞等正常細胞影響很小，所以相對于一般的化療藥物有非常顯著的優勢。

本實驗將天花粉蛋白處理人宮頸癌HeLa細胞后，HeLa細胞的生長受到明顯抑制。出現凋亡的特征性改變，凝膠電泳呈現典型的梯級格局，而且凋亡細胞的比例隨藥物濃度的增高及作用時間的延長而增高。這些結果表明天花粉蛋白能抑制HeLa細胞增殖，誘導人宮頸癌HeLa細胞發生凋亡。有關天花粉蛋白誘導HeLa細胞凋亡的具體機制尚在進一步研究之中，天花粉蛋白有良好的應用前景，廣大醫學研究者共同努力，將其早日應用于臨床抗宮頸癌的治療，為宮頸癌患者的康復帶來新的福音。

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