急性白血病細胞系中SFRP基因啟動子甲基化及去甲基化誘導表達的研究

徐成波， 馮 敏， 廖 斌， 皇甫真萍， 齊 彥， 陳毅寧， 陳佳薇， 沈建箴

(1福建中醫藥大學附屬人民醫院血液科，福建福州350004;2福建省立醫院北院，福建省老年醫院內分泌科，福建福州350001;3福建醫科大學附屬協和醫院血液科，福建福州350001)

Wnt信號通路的過度激活參與了人類多種腫瘤的形成，被認為是腫瘤發生過程中的關鍵信號通路。分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRP)作為Wnt信號通路的胞外拮抗物，能通過多種機制抑制經典和非經典的Wnt通路［1］，阻斷異常激活的Wnt信號，促進腫瘤細胞凋亡，達到抑制腫瘤的形成與發展。為了探討SFRP基因家族啟動子CpG島異常甲基化狀態在急性白血病(acute leukemia，AL)發生發展中的作用，本研究擬采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)的方法檢測白血病細胞系和不同濃度的5-氮雜-2’-脫氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR)作用下 Jurkat細胞中 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因啟動子區的甲基化，并檢測 SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DNA 甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1、DNMT3A 和 DNMT3B mRNA表達的變化，以期從表觀遺傳學水平揭示AL的發病機制。

材料和方法

1 材料

實驗用急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)細胞為Molt-4和 Jurkat細胞，急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)細胞為HL-60和NB4細胞，均由福建省血液病研究所傳代保存。

小牛血清(杭州四季青公司);RPMI-1640培養基(Gibco);5-Aza-CdR、蛋白酶K、RNA酶、亞硫酸氫鈉和氫醌(Sigma);淋巴細胞分離液和酚-氯仿DNA抽提液(上海生物工程公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)和Trizol試劑(上海生物工程公司);Wizard DNA樹酯純化試劑盒(Promega);Platinum? SYBR? Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒(Invitrogen);2×Taq PCR Master Mix試劑(北京博邁德生物公司);DNA marker(廈門鷺隆生物有限公司)。引物由Invitrogen合成。

37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱(Heal Force);DU-640紫外分光光度儀(Beckman Coulter);Gel Doc 1000凝膠圖像分析儀(Bio-Rad);7700型PCR擴增儀和7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 細胞培養及干預實驗 所用AL細胞均常規復蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液(pH 7.2)，于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養，隔天傳代1次，實驗用細胞為對數生長期細胞。SFRP基因去甲基化實驗中，取對數生長期的Jurkat細胞，調整細胞濃度為1×109/L，并接種于培養瓶中，未處理組細胞即不加藥培養72 h作為空白對照，其余分別加入5-Aza-CdR 1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L處理，共培養72 h，用藥結束后，收集各組細胞，進行DNA和RNA的提取，用于進一步的研究。

2.2 正常人骨髓或外周血單個核細胞的提取 骨髓穿刺檢查或抽取外周血時，留取骨髓標本或外周血2 mL，肝素抗凝。在離心管中加入2倍體積的淋巴細胞分離液，顛倒混勻。將骨髓標本或血標本離心20 min。離心后，上層為血清，中間層為單個有核細胞，下層為紅細胞和血小板。小心吸取中間層的單個核細胞，洗滌離心后備用。

2.3 細胞基因組DNA的提取 收集各實驗組細胞以及正常人骨髓或外周血單個核細胞，常規酚-氯仿法提取細胞基因組DNA，并通過紫外分光光度儀鑒定其含量及純度。用去離子水溶解后于-20℃保存。

2.4 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾與純化 參考Herman等［2］的方法并加以改進，取1～2μg DNA溶解于50μL去離子水中，加3 mol/L NaOH 5.5μL，37℃水浴30 min。向堿變性的DNA中加入新配置的10 mmol/L氫醌30μL和3 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，以礦物油3滴覆蓋液面，50℃水浴16 h。再用Wizard DNA Clean-Up System純化，純化后的DNA加3 mol/L NaOH 5.5μL，室溫放置15 min，用預冷的70%乙醇沉淀DNA，并以30μL去離子水溶解，-20℃儲存備用。

2.5 MSP檢測 取經亞硫酸氫鈉修飾后的DNA 3 μL為模板，采用25μL體系進行擴增，體系包含12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，甲基化或非甲基化的上、下游引物各0.5μL，補足水至25μL。反應條件為95℃預變性4 min，95℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環，72℃ 10 min。同時，以修飾后的正常人骨髓或外周血單個核細胞DNA為非甲基化陰性對照，將已經證實均存在 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因高甲基化的人結直腸癌細胞系RKO細胞DNA為甲基化陽性對照［3］，H2O作空白對照。將PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠圖像分析儀上自動分析成像。應用甲基化引物擴增出基因甲基化產物的細胞，定為該基因完全甲基化;應用非甲基化引物擴增出基因非甲基化產物的細胞，定為該基因完全非甲基化;同時可擴增出甲基化和非甲基化產物的細胞，定為該基因部分甲基化。

2.6 實時熒光定量RT-PCR檢測SFRP mRNA的表達水平 各組細胞至培養終點后以Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，并鑒定RNA的完整性。以2μg RNA為模板逆轉錄合成cDNA，實時定量RT-PCR采用7500型熒光定量PCR儀和Platinum? SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒進行PCR擴增，以GAPDH為內參照。采用與GAPDH比較Ct值的方法來定量mRNA表達水平，實驗重復3次。

2.7 半定量RT-PCR檢測DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達水平 采用7700型PCR擴增儀和2×Taq PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增，以GAPDH為內參照，將PCR產物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠圖像分析儀上自動分析成像，以目的條帶與GAPDH條帶的吸光度比值進行半定量分析，實驗重復3次。

3 統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，SPSS 17.0統計軟件分析數據，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AL細胞系中SFRP基因的甲基化狀態

在 Molt-4、Jurkat、HL-60 和 NB4 細胞中，應用甲基化引物可擴增出的 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化產物特異性條帶，同時應用非甲基化引物在HL60細胞中可擴增出SFRP4基因的非甲基化產物，表明 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因在Molt-4、Jurkat和NB4細胞中均呈完全甲基化狀態，而 HL-60細胞中 SFRP1、SFRP2和SFRP5呈完全甲基化狀態，而SFRP4基因呈部分甲基化狀態，見圖1。正常人骨髓或外周血單個核細胞應用非甲基化引物可擴增出SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的非甲基化特異性條帶，而甲基化引物不能擴增出特異性產物，表明正常人細胞中SFRP基因均呈非甲基化狀態。

Figure 1.MSP analysis of SFRP1，SFRP2，SFRP4 and SFRP5 genes in Molt-4，Jurkat，HL-60 and NB4 cell lines.M:methylated;U:unmethylated;NC:negative control;PC:positive control;H2 O:blank control.圖1 4種AL細胞中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化分析

2 SFRP2基因甲基化MSP產物的序列分析

為了證實MSP分析基因甲基化的可靠性，隨機挑選了SFRP2基因甲基化引物擴增的PCR產物，經T-A克隆后測序。測序結果證明該MSP產物是野生型(wild-type)SFRP2基因啟動子區的部分序列，其分析結果完全可靠。甲基化的SFRP2基因，其CpG島二核苷酸中的胞嘧啶(C)堿基未被亞硫酸氫鹽硫化改變，仍為C堿基;而在非CpG島中的C堿基經亞硫酸氫鹽修飾后都轉變成胸腺嘧啶(T)堿基，見圖2。

Figure 2.Sequence analysis of the MSPproduct of methylated SFRP2 gene after bisulfite treatment.Wild-type cytosine(C)residues that were methylated in CpGislands(framed)remained unchanged，and Cresidues that were unmethylated were changed to thymidine(T)by bisulfite-induced deamination(underlined).圖2 SFRP2基因甲基化MSP產物的序列分析

3 Jurkat細胞經5-Aza-Cd R處理后SFRP基因甲基化水平的改變

用不同濃度5-Aza-CdR處理Jurkat細胞72 h后，MSP分析顯示，隨著5-Aza-CdR濃度的升高，SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化水平(吸光度值)逐漸降低，見圖3，提示SFRP基因的高甲基化狀態被逆轉。

Figure 3.MSPanalysis of SFRP genes in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.圖3 5-Aza-Cd R處理Jurkat細胞后SFRP基因甲基化水平的變化

4 Jurkat細胞經5-Aza-Cd R處理后SFRP mRNA表達水平的改變

4 μmol/L 5-Aza-CdR 組中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表達水平均明顯升高，分別是未處理組中表達水平的4.6、3.5、2.3和4.2倍(均P＜0.01)，見圖4，提示SFRP基因的高甲基化狀態被逆轉后，甲基化沉默的SFRP基因被激活轉錄。

Figure 4.The mRNA expression levels of SFRP in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR at the concentration of 4 μmol/L.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 5-Aza-CdR處理Jurkat細胞72 h后SFRP mRNA表達水平的變化

5 Jurkat細胞經5-Aza-Cd R處理后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平的變化

半定量RT-PCR檢測發現，隨著5-Aza-CdR濃度升高以及SFRP基因甲基化水平的降低，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達水平均有下調，且呈劑量依賴性，各藥物作用組與未處理組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Semiquatitative RT-PCR analysis of DNMT1，DNMT3A and DNMT3B mRNA expression in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0μmol/L.圖5 5-Aza-CdR處理Jurkat細胞后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平的變化

討 論

DNA甲基化是真核生物基因組最常見的一種表觀遺傳學修飾方式，它對X染色體滅活［4］、基因組印跡［5］、DNA 修復［6］和基因表達調控［7］等起著非常重要的作用?；蚪M特定序列的低甲基化或高甲基化都會使基因的表達發生變化。大約90%的DNA甲基化發生在啟動子區的CpG島，正常生理條件下絕大部分啟動子CpG島均處于非甲基化狀態，一旦基因的CpG島發生高甲基化將直接導致基因的轉錄失活。

Wnt信號通路調控著細胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等許多生命過程［8］。研究表明，Wnt異常信號通路激活癌癥的重要機制是一種或多種可溶性Wnt抑制基因的甲基化沉默所致，SFRP作為Wnt信號通路的負調控因子，其基因表達下調可引起Wnt信號通路持續異常激活，從而最終引起包括胃腸道腫瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌及間皮瘤等腫瘤的發生，被認為是腫瘤發生過程中的關鍵信號通路［9］。

SFRP作為Wnt信號途徑的“門戶”，在正常情況下能有效地抑制Wnt途徑的異常激活。但是，在SFRP基因發生甲基化沉默后則失去這種作用［10］。Chim等［11］利用骨髓瘤細胞株及原發性骨髓瘤標本研究Wnt信號通路的激活情況，發現在4組細胞株中，LP1及WL2細胞株存在Wnt信號的異常激活，且與多種Wnt抑制基因超甲基化沉默有關，去甲基化后抑制基因可重新恢復表達，Wnt通路活化水平也開始下調。同時，在初發多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者中，有42%的患者存在至少一種抑制基因的甲基化，其中61.9%有2種以上抑制基因的甲基化。Jost等［12］對76例初治MM患者的SFRP基因進行甲基化檢測，發現有35.5%的 SFRP1、52.6%的SFRP2、1.3%的SFRP4和6.9%的SFRP5存在高甲基化，而且SFRP5的高甲基化可能與疾病的進展有關。Liu等［13］在對20例慢性B淋巴細胞白血病患者的研究中發現，SFRP基因普遍存在DNA甲基化沉默，SFRP1、SFRP2和SFRP5基因基因的甲基化比率分別是100%、55%、30%和15%。

本研究應用 MSP技術檢測發現，SFRP1、SFRP2、SFRP4 和 SFRP5 基因在 Molt-4、Jurkat和NB4細胞中均呈完全甲基化狀態，而HL-60細胞中SFRP1、SFRP2和SFRP5基因呈完全甲基化狀態，SFRP4基因呈部分甲基化狀態，因此推測，SFRP基因在AL中發生高頻率甲基化。

白血病的DNA去甲基化治療已成為AL治療研究的新熱點［14］。去甲基化藥物5-Aza-CdR是美國FDA批準的第一批用于治療MDS的表觀遺傳藥物。5-Aza-CdR過去主要作為抗腫瘤細胞毒藥物使用，阻斷細胞向S期轉化。本實驗發現5-Aza-CdR作用Jurkat細胞72 h后，隨著藥物終濃度的增加，SFRP mRNA的表達水平隨著甲基化程度的降低而增高，這表明SFRP基因去甲基化后重新恢復表達。與此同時，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達水平也呈劑量依賴性的表達下調。由于5-Aza-CdR是核苷類似物，磷酸化后能與DNMT形成共價復合物，抑制其與DNA結合發揮甲基化活性，從而誘導DNA去甲基化［15］。因此，推測5-Aza-CdR可能通過抑制DNMT表達，阻斷DNMT轉移S-腺苷蛋氨酸的甲基于CpG島的5-胞嘧啶上而逆轉DNA啟動子區CpG島的甲基化，重新激活因高甲基化而處于沉默的SFRP基因，而達到去甲基化激活轉錄的作用。但是由于5-Aza-CdR對基因的去甲基化作用缺乏細胞特異性，它在治療異常甲基化的同時，可能會引起處于抑制狀態的某些基因恢復活性，導致正?；蛘{控機制的紊亂，所以5-Aza-CdR廣泛應用于臨床還需要進一步的探索。