多囊卵巢綜合征患者血清中蛋白因子的變化及其臨床意義*

杭 晨， 楊煒敏△， 何善陽， 黃若磐

(1無錫市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫214002;2中山大學第一附屬醫(yī)院黃埔院區(qū)，廣東廣州510700;3RayBiotech公司，美國佐治亞州諾克羅斯市30092)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome， PCOS)是婦產(chǎn)科領(lǐng)域中最常見的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病率在育齡婦女中約5% ～10%，在月經(jīng)異常婦女中約70% ～80%［1］。因其臨床癥狀、血激素生化檢查及卵巢超聲表現(xiàn)都存在異質(zhì)性，給臨床研究帶來困難。雖然已進行了大量研究，PCOS的發(fā)病機制至今不清。越來越多的研究證據(jù)表明，PCOS的概念已經(jīng)遠遠超出了婦科內(nèi)分泌學的范疇，對其發(fā)病機理的研究也不再局限于性腺軸及卵巢局部內(nèi)分泌因素，而是深入到免疫學、遺傳學等多個方面。蛋白質(zhì)組學的研究方法能夠同步識別鑒定細胞、組織或機體的多種蛋白質(zhì)，并分析蛋白質(zhì)的功能及其模式，能夠同時反映細胞內(nèi)部的遺傳特性和外界因素的影響，為在蛋白質(zhì)水平對疾病進行研究提供廣闊的技術(shù)平臺。本實驗采用可吸附蛋白質(zhì)的膜為載體，采用抗體蛋白質(zhì)芯片同時檢測在多囊卵巢綜合征患者及正常對照組血清中174種蛋白因子的表達，旨在探討與多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子標志物，為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 對象

選取南京醫(yī)科大學附屬無錫婦幼保健院婦科門診2010年1～6月門診診斷為PCOS的患者3例，采用2003年ESHRE/ASRM的診斷標準［2］:(1)偶發(fā)排卵和(或)無排卵;(2)臨床和(或)生化指標提示高雄激素血癥，并排除其它可能致病的因素，如先天性腎上腺增生、分泌雄激素腫瘤、Cushing綜合征等;(3)卵巢多囊性改變:B超檢查示≥12個直徑2～9 mm卵泡和(或)卵巢體積增大＞10 mL。符合其中兩項者即可診斷為PCOS。以同期門診健康體檢女性3例為對照。所有入選者均于清晨空腹抽取肘靜脈血4 mL，靜置分離血清后放于－80℃凍存。

2 方法

2．1 蛋白質(zhì)芯片檢測 使用抗體蛋白質(zhì)芯片試劑盒2000(人類細胞因子系列6、7、8;由RayBiotech提供，廣州瑞博奧生物科技有限公司代理)，操作過程按試劑盒說明書進行并略作修飾。具體方法為:將已包被抗體的蛋白質(zhì)芯片膜浸泡于BSA緩沖液室溫孵育30 min，以阻斷非特異性反應，然后將膜與1∶10稀釋的血清于搖床上室溫孵育4 h，緩慢搖動，使反應均勻，充分洗膜，洗去非特異結(jié)合物，加2 mL生物素結(jié)合的抗體，4℃孵育過夜，再次徹底洗膜，加Cy3結(jié)合的鏈霉親和素，搖床上室溫孵育1 h，緩慢搖動充分洗膜，使反應均勻;Affymetrix激光成像掃描儀掃描照相;并進行密度分析，以5%BSA為陰性對照。

2．2 ELISA法檢測蛋白質(zhì)芯片結(jié)果變化顯著的2個蛋白因子 通過查找文獻篩選出目前無血清學檢測結(jié)果報道的因子——血小板源性生長因子 BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)及脂聯(lián)素(adiponectin或adipocyte complement-related protein of 30 kD，Acrp30)，其蛋白質(zhì)芯片表達強度增加分別為2.8倍和1．5倍，見結(jié)果2。檢測同期PCOS門診患者及對照組體檢健康女性各30例PDGF-BB及Acrp30水平變化，驗證其改變是否具有統(tǒng)計學意義。

3 統(tǒng)計學處理

原始數(shù)據(jù)(光點密度)使用RayBiotech蛋白質(zhì)芯片分析工具軟件分析，根據(jù)單個膜陽性與陰性對照值進行標準化處理及減除背景處理，再進行組間比較。組間比較采用t檢驗，SPSS 10．0軟件分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 抗體蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果

使用抗體蛋白質(zhì)芯片試劑盒2000同步檢測174種分泌型血清蛋白因子在PCOS患者及對照組血清中的水平。抗體蛋白質(zhì)位點圖見圖1，蛋白因子檢測結(jié)果見表 1、2。

2 PCOS組血清174種蛋白因子的改變

2．1 PCOS組表達增高的因子 經(jīng)統(tǒng)計有23種因子在PCOS組升高，分別為血管生長素(angiogenin)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 1(insulin-like growth factorbinding protein 1，IGFBP-1)、IGFBP-4、白細胞介素 7(interleukin-7，IL-7)、巨噬細胞炎癥蛋白1δ(macrophage inflammatory protein 1 delta，MIP-1-delta)、肺活化調(diào)節(jié)趨化因子(pulmonary and activation-regulated chemokine，PARC)、PDGF-BB、Acrp30、EGF 受體(EGF receptor，EGFR)、細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、可溶性 TNF受體I(soluble TNF receptor I，sTNFRI)、金屬蛋白酶組織抑制物 2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2)、TNF相關(guān)凋亡誘導配體受體3(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 3，TRAIL-R3)、E-選擇素(E-selectin)、IL-1受體 II(IL-1 receptor II，IL-1RII)、IL-5受體 α (IL-5 receptor alpha，IL-5Ra)、潛在相關(guān)肽(latency-associated peptide，LAP)、L-選擇素(L-selectin)、巨噬細胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)、PDGF-AA、泌乳素(prolactin)和血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)。

Figure 1．The results of human serum protein array from PCOSand control groups．圖1 PCOS患者及對照組血清蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果

表1 在PCOS組中增高的血清蛋白因子Table 1．Serum protein factors increased in PCOSpatients compared with the controls

表2 在PCOS組中降低的血清蛋白因子Table 2．Serum protein factors decreased in PCOSpatients compared with the controls

2．2 PCOS組表達降低的因子 有3種，包括生長調(diào)節(jié)癌基因(growth-regulated oncogene，GRO)、IL-8和Siglec-5。

3 PCOS組表達明顯增高的蛋白因子

PCOS組蛋白因子表達強度增高達3倍以上的為 IL-1RII、prolactin、IL-7、IGFBP-1、IL-5Ra、IGFBP-4、VEGFR2、ICAM-1 和 MIP-1-delta。

4 ELISA驗證PDGF-BB及Acrp30

PCOS組及對照組血清中的 PDGF-BB為:(247.32±30.70)ng/L vs(204.51±28.55)ng/L(P＜0.05)。PCOS組及對照組血清 Acrp30為(109.86±49.62)μg/L vs(85.91±38.69)μg/L(P ＜0.05)。

討 論

既往研究顯示［3］人類生殖腺是細胞因子產(chǎn)生與作用的部位，PCOS以生殖功能異常為基本特征，伴有免疫細胞、細胞因子及凋亡調(diào)節(jié)等多種改變，而免疫系統(tǒng)與生殖細胞的交互作用是復雜的、網(wǎng)絡(luò)式的。近年來對PCOS的免疫學因素，尤其細胞因子等方面的研究取得了較大進展［4-5］，主要研究內(nèi)容可分為三大類:(1)炎性反應因子類;(2)生長因子類;(3)脂肪細胞因子類。卵巢正常功能受機體內(nèi)分泌及卵巢局部內(nèi)調(diào)節(jié)因子協(xié)調(diào)作用的影響，構(gòu)成卵巢功能復雜的調(diào)節(jié)機制。生物活性因子在不同條件下多有變異，目前的研究尚不能全面說明這些因子和外來因素如何協(xié)調(diào)影響卵泡發(fā)育及其在PCOS發(fā)病機制中的作用。

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)成為滿足人們對蛋白質(zhì)的高通量、高敏感性，平行分析研究的有力工具。國內(nèi)曾有報道采用WCX2蛋白質(zhì)芯片檢測31例PCOS患者和30例正常對照血清蛋白譜，用質(zhì)譜儀篩選出PCOS患者與正常對照組相比的23種差異蛋白，從中再次篩選出4種蛋白質(zhì)組成PCOS的蛋白譜最優(yōu)化模型，其敏感性和特異性分別為83．3%和86．7%，認為可對PCOS做很好的診斷預測［6］。他們采用的是飛行時間質(zhì)譜法，該方法雖然簡便靈敏特異，不失為一種早期診斷的好方法，但不能明確所篩選出的蛋白標志物為何種蛋白，因此無法確定其作用。而對于PCOS患者，我們除了希望明確診斷外，更希望明確其異質(zhì)性臨床特征的歸屬性。

目前已商品化并得到廣泛應用的蛋白質(zhì)芯片中的大部分是使用表面加強的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜方法［7］，這種方法能夠獲得可重復的、統(tǒng)一的質(zhì)譜圖，可用于定量蛋白質(zhì)研究，其有許多傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究方法無法比擬的優(yōu)勢如高通量、快速、平行、自動化等，已用于多領(lǐng)域的研究。但是它的缺點在于:(1)不能給出除蛋白質(zhì)的分子量和豐度之外的其它信息，蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能尚需其他方法檢測;(2)檢測的靈敏度在很大程度上取決于配套的儀器設(shè)備和生物信息學處理軟件，操作復雜，設(shè)備昂貴，數(shù)據(jù)處理尚未規(guī)范，因此難以在臨床上普遍應用。本研究使用的抗體蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，為國內(nèi)首例報道使用類似芯片用于PCOS患者血液檢測，除具有蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)點外，操作簡便易學，無需任何特殊儀器設(shè)備，可根據(jù)需要調(diào)整或擴大抗體庫，設(shè)計特異性的PCOS蛋白質(zhì)檢測芯片，可能為患者細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)提供更全面的資料，已廣泛用于腫瘤等疾病的研究［8］。

本研究使用抗體蛋白質(zhì)芯片反應體系通過對常見的分泌型蛋白因子庫共174種因子的檢測篩選，發(fā)現(xiàn)共有23種因子在PCOS組升高，降低的因子有GRO、IL-8和Siglec-5。其中表達強度在PCOS組增高達 3倍以上的因子為 IL-1RII、prolactin、IL-7、IGFBP-1、IL-5Ra、IGFBP-4、VEGFR2、ICAM-1 和 MIP-1-delta。這說明PCOS患者可能存在全身性免疫因子改變，以部分生長因子家族成員及炎癥因子為主。在這些因子中有的已經(jīng)證實與PCOS相關(guān)，如IGFBP［9］、EGF［10］、VEGF［11］、TNF［12］、ICAM-1［13］、IL-1［14］、Acrp30［15］、TIMP-2［16］、E-selectin［17］、L-selectin［18］等。本研究不僅再次印證了其作用，而且區(qū)分出了其作用的亞型，為進一步明確其作用機制及相互影響打下了基礎(chǔ)。有些因子為既往沒有發(fā)現(xiàn)與PCOS相關(guān)的蛋白，如 angiogenin、IL-7、IL-8、MIP-1-delta、PDGF-BB、PDGF-AA、PARC、TRAIL-R3、IL-5Ra、M-CSFR和GRO等，為進一步研究其作用提供了依據(jù)。通過查找文獻篩選出目前無血清學檢測結(jié)果報道的PDGF-BB及Acrp30，其蛋白質(zhì)芯片表達強度增加分別為2．8倍和1．5倍。采用 ELISA檢測PDGF-BB及Acrp30水平變化，結(jié)果與蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果一致且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

綜上所述，本研究初步篩查了小樣本PCOS患者的血清蛋白因子水平，發(fā)現(xiàn)23種蛋白因子的表達異常，其中9種因子的表達強度在PCOS組較對照組增高3倍以上，為進一步設(shè)計特異性的PCOS蛋白質(zhì)檢測芯片打下了基礎(chǔ)，并有望使用特異性的PCOS蛋白質(zhì)檢測芯片為PCOS相應的個體化治療提供依據(jù)，為難治病例發(fā)展新的治療方法。