SB203580在電壓依賴性鉀離子通道阻斷劑4-氨基吡啶增強大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收縮中的作用*

馬迎春， 陳海娥， 黃林靜， 何金波， 王淑君， 陳 丹， 汪 洋，2， 王萬鐵，2△

(溫州醫科大學1基礎醫學院病理生理學教研室，2缺血/再灌注損傷研究所，浙江溫州325035;3赤峰上京內分泌專科醫院，內蒙古 赤峰024000)

肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)上鉀離子通道功能異常在低氧性肺血管收縮及血管重構中均發揮重要作用［1］，其中最重要且研究較多的是電壓依賴性鉀離子通道。近年來有關絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路和低氧之間的關系越來越受到關注，逐漸成為研究的熱點。p38 MAPK是MAPK信號家族一重要成員，可被許多應激刺激(包括低氧、活性氧)及某些G蛋白偶聯受體激活，引起一系列生物化學反應［2-3］。本室先前研究［4］表明:在急性低氧高二氧化碳條件下，p38 MAPK信號通路抑制劑SB203580能減弱二級肺動脈環的II期持續收縮反應。那么p38 MAPK信號通路在低氧高二氧化碳性肺血管收縮(hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV)中發揮的作用與鉀離子通道是否有關系，目前未見詳細報道。本研究采用電壓依賴性鉀離子通道(voltage-dependent K+channel，KV)阻斷劑——4-氨基吡啶(4-aminopyridione，4-AP)及SB203580在急性低氧高二氧化碳條件下孵育SD大鼠離體二級肺動脈環，動態觀察血管環收縮張力的變化，探討KV和p38 MAPK信號通路對急性HHPV的影響。

材料和方法

1 動物和試劑

清潔級雄性SD大鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供［SCXK(浙)2010-0044］。SB203580購自Biosource，DMSO購自上海申工生物技術有限公司，重酒石酸去甲腎上腺素購自上海禾豐制藥有限公司，乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和4-AP購自 Sigma。其余均為市售分析純。

2 大鼠離體肺動脈環灌流模型的復制

SD大鼠36只，體重(300±20)g，隨機均分成6組(n=6)，按照本室先前報道的方法［4］制備大鼠低氧高二氧化碳性二級肺動脈環灌流模型，并平衡動脈環，檢測內皮的完整性。

3 電壓依賴性鉀離子通道阻斷劑4-AP及p38 MAPK信號通路抑制劑SB203580對HHPV的影響

在急性低氧高二氧化碳介質中，分別用4-AP及4-AP和SB203580聯合孵育二級肺動脈環20 min，動態觀察藥物處理對HHPV的影響。所有二級肺動脈環隨機分為:(1)常氧組(N組);(2)低氧高二氧化碳組(H組);(3)低氧高二氧化碳+DMSO組(HD組);(4)低氧高二氧化碳 +4-氨基吡啶組(4-AP組);(5)低氧高二氧化碳+SB203580組(SB組);(6)低氧高二氧化碳+4-氨基吡啶+SB203580組(4-AP+SB組)。N組和H組不做藥物處理，HD組、4-AP組、SB組和 4-AP+SB組分別用 DMSO(0.05%)、4-AP(10-3mol/L)、SB203580(10-5mol/L)和4-AP(10-3mol/L)+SB203580(10-5mol/L)孵育20 min，然后按照低氧高二氧化碳反應性測定方法(除N組外)檢測肺動脈環張力的變化。

4 統計學處理

用SPSS17.0統計軟件分析，計量資料均進行正態性檢驗，數據(張力變化率)以均數 ±標準差(mean±SD)表示，多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗和單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnett's T3檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 低氧高二氧化碳對二級肺動脈環張力的直接影響

N組持續通入95%O2+5%CO2混合氣體60 min，張力變化率(tension percentage change，P%)未見明顯變化，見圖1A、表1。H組持續通入92%N2+8%CO2混合氣體60 min，其張力曲線呈雙相性收縮(biphasic vasoconstriction):即在急性低氧高二氧化碳條件下1～5 min內出現一個短暫、明顯的收縮峰(I期快速收縮，phase I vasoconstriction)，5 ～15 min此收縮峰表現為較明顯的舒張(I期舒張，phase I vasodilation)，15～20 min后又出現緩慢、持久的收縮(II期持續收縮，phase II vasoconstriction);H組二級肺動脈環的 P%與常氧組相比，差異顯著(P＜0.05)，見圖1B、表1。HD組作為溶劑對照組，與H組相比，二級肺動脈環P%變化不明顯(P＞0.05)，見圖1C、表1。

2 4-AP在急性低氧高二氧化碳介質中對二級肺動脈環HHPV的影響

選用4-AP孵育二級肺動脈環時發現，4-AP可增強二級肺動脈環的HHPV，尤其是II期持續收縮，與HD組相比，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1D、表1。

3 SB203580在急性低氧高二氧化碳介質中對二級肺動脈環HHPV的影響

用SB203580孵育二級肺動脈環時發現，SB203580可明顯緩解急性低氧高二氧化碳引起的二級肺動脈環II期持續性收縮，但I期快速收縮沒有明顯變化，與HD組相比，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1E、表 1。

4 4-AP與SB203580聯合應用在HHPV中的作用

用4-AP與SB203580聯合孵育二級肺動脈環，發現SB203580能減弱4-AP所致的肺動脈環收縮幅度，使血管環張力下降。在急性低氧高二氧化碳介質中，4-AP+SB組I期收縮和I期舒張變化不明顯，但收縮峰值較HD組明顯下降，II期持續收縮逆轉為舒張狀態(P＜0.05或P＜0.01);4-AP+SB組二級肺動脈環II期持續收縮顯著緩解，與HD組、4-AP組和SB組相比，均有顯著差異(P＜0.05或 P＜0.01)，見圖1F、表1。

Figure 1.Dynamic changes of the tension of the second-order pulmonary artery rings in the six groups.A:control group;B:hypoxia hypercapnia group;C:hypoxia hypercapnia+DMSO incubation group;D:hypoxia hypercapnia+4-AP group;E:hypoxia hypercapnia+SB203580 incubation group;F:hypoxia hypercapnia+4-AP+SB203580 incubation group.圖1 6組二級肺動脈環張力的動態變化

討 論

低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)的發生機制與PASMCs膜電位(membrane electricity，Em)變化密切相關。PASMC的張力主要受Em調控，膜去極化可激活L型鈣通道(L-type voltage-dependent calcium channels，L-VDC)，導致細胞外Ca2+內流，胞質Ca2+濃度升高，觸發興奮收縮偶聯機制，引起平滑肌細胞收縮。而膜電位的大小取決于細胞膜上各種離子通道的活性，其中鉀通道的作用至關重要。PASMCs上與HPV相關的鉀通道主要有以下4種:(1)KV，包括延遲整流性鉀通道(delayed rectifier K+channels，KDR)、瞬時外向鉀通道(transient out ward K+channels，Kto)及緩慢激活的非失活性鉀通道(non-inactivating K+channels，KN);(2)鈣激活性鉀通道(calcium-activated potassium channels，KCa)，KCa通道根據電導值的不同分為高(BKCa)、中(IKCa)、低電導(SKCa)的鈣激活鉀通道，其中在血管平滑肌上分布廣泛的是BKCa;(3)內向整流性鉀通道(inward rectifier potassium channels，Kir);(4)ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP)，KATP是由內向整流性孔區(Kir)和磺酰脲受體(sulfonylurea receptor，SUR)組成的八聚體，特異性阻斷劑是格列苯脲(glybenclamide，Gly)。還有一種雙孔區鉀通道(two-pore potassium channels，Kt)正在研究中［5-6］。低氧可使 KV及 Kt受抑制，導致膜發生除極，引起L-VDC開放，Ca2+內流增加，觸發興奮收縮偶聯機制［7］。洪志剛等［8］在離體大鼠肺的研究中指出，有些鉀離子通道阻斷劑可增加低氧狀態下肺血管張力進而增強HPV，由此我們可以認為HPV是通過對鉀離子通道的直接調控引起細胞膜去極化所致。周敏等［9］的實驗結果亦支持肺動脈平滑肌細胞膜上的KV在低氧性肺血管收縮中起重要作用。因此，我們選用KV的阻斷劑4-AP孵育急性低氧高二氧化碳介質中的二級肺動脈環，觀察其HHPV的張力變化。結果發現經4-AP孵育的血管環HHPV的收縮幅度增強，Ⅱ期持續收縮較明顯。我們的實驗結果驗證了KV與HHPV密切相關，阻斷KV可增強肺動脈環HHPV收縮的幅度。這可能是因為肺血管的收縮與其血管平滑肌細胞膜電位變化密切相關，而膜電位的變化又直接調控血管張力的變化。

表1 6組二級肺動脈環張力的動態變化Table 1.The tension percentage changes of the second-order pulmonary artery rings in the six groups(Mean±SD.n=6)

MAPK即絲/蘇氨酸蛋白激酶，是一種細胞外信號調節激酶，它參與了細胞生長、發育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種生理反應過程。p38 MAPK通路又稱為應激激活的MAPK通路，實驗中我們用p38 MAPK通路抑制劑SB203580孵育急性低氧高二氧化碳介質中的二級肺動脈環，結果發現SB203580可明顯緩解急性低氧高二氧化碳引起的二級肺動脈環II期持續性收縮，但I期快速收縮沒有明顯變化，這與我們之前的研究結果是一致的［4］。在此基礎上，為了進一步研究其與鉀離子通道的關系，我們用4-AP與SB203580聯合孵育二級肺動脈環，發現在低氧高二氧化碳條件下II期持續收縮明顯下降，說明p38 MAPK信號通路可能在鉀離子通道受阻斷引起的II期持續收縮中發揮著重要的作用。因此我們有理由認為SB203580能夠緩解因KV阻斷而引起的HHPV。

在急性低氧高二氧化碳的條件下MAPK信號通路被激活，引起肺動脈平滑肌細胞收縮，而在此過程中鉀離子通道呈現出受阻斷的關閉狀態，導致細胞膜去極化而產生細胞收縮。由此我們可以推斷MAPK通路與鉀離子通道之間可能存在著一定的聯系，我們通過抑制 p38 MAPK通路緩解肺動脈的HHPV，而在此過程中鉀離子通道可能處于開放狀態，從而可以使肺動脈平滑肌細胞膜電位趨于復極化狀態，減少鈣離子內流，從而緩解其收縮程度。

綜上所述，KV阻斷劑4-AP可增強HHPV的作用，抑制p38 MAPK通路可以緩解4-AP引起的肺動脈HHPV。p38 MAPK信號通路的參與可能是電壓依賴性鉀離子通道調節低氧高二氧化碳肺動脈高壓形成的重要機制之一，它們之間具體的作用機制尚待進一步研究。