TRPV1激活對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織炎癥損傷的影響及機(jī)制*

施孟如， 南 超， 徐麗艷， 韓文文， 徐子琴， 李 冬， 邱俏檬， 盧中秋△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江溫州325035;2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心，3溫州市人民醫(yī)院，浙江溫州325000)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥，可引起膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征，其中急性肺損傷是最常見(jiàn)的并發(fā)癥［1］。研究表明，Toll樣受體4-核因子 κB(Toll-like receptor 4-nuclear factorκB，TLR4-NF-κB)通路活化介導(dǎo)的過(guò)度炎癥反應(yīng)在膿毒癥肺損傷中起重要作用［2-3］。瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道V亞族成員1(transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1，TRPV1)廣泛分布于感覺(jué)神經(jīng)纖維末梢上(C和Aδ)，感受傷害性刺激和疼痛。近年發(fā)現(xiàn)，TRPV1與TLR4及CD14共定位于感覺(jué)神經(jīng)末梢［4］，在膿毒癥中可被激活，并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的程度［5-6］。TRPV1活化是否參與調(diào)節(jié)膿毒癥肺損傷的炎癥反應(yīng)過(guò)程尚不明確。本研究以腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制造ICR小鼠內(nèi)毒素血癥模型，用辣椒素(capsaicin，CAP)和抗辣椒堿(capsazepine，CAPZ)分別激活和拮抗TRPV1，觀察小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路及下游腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和IL-10的變化，以及P物質(zhì)(substance P，SP)和降血鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)水平隨TRPV1激活的變化情況，探討TRPV1活化對(duì)內(nèi)毒素血癥肺損傷炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制。

材料和方法

1 試劑

LPS、CAP 和 CAPZ 購(gòu)自 Sigma;IL-6、TNF-α、IL-10、CGRP和SP的ELISA試劑盒購(gòu)自R＆D Systems，上海西唐生物科技有限公司進(jìn)口分裝;抗小鼠NF-κB p65Ⅰ抗購(gòu)自 Abcam;抗小鼠 TLR4Ⅰ抗購(gòu)自Santa Cruz;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自Milipore;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、RIPA裂解液(強(qiáng))、彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、顯影劑和定影劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;ECL發(fā)光液購(gòu)自Advansta。

2 方法

2．1 動(dòng)物分組及干預(yù) SPF級(jí)ICR小鼠108只，雄性，體重(20±2)g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。將小鼠隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組(n=18)、CAP對(duì)照組(n=18)、CAPZ對(duì)照組(n=18)、內(nèi)毒素血癥組(n=18)、CAP干預(yù)組(n=18)和CAPZ干預(yù)組(n=18)。正常對(duì)照組:給小鼠腹腔注射生理鹽水，3 h、8 h和16 h后麻醉活殺;CAP和CAPZ對(duì)照組:實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30 min預(yù)先給小鼠皮下注射CAP(1 mg/kg)或CAPZ(15 mg/kg)，腹腔注射生理鹽水后分別于3 h、8 h和16 h麻醉后活殺;內(nèi)毒素血癥組:給小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg后3 h、8 h和16 h麻醉后活殺;CAP和CAPZ干預(yù)組:實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30 min預(yù)先分別給小鼠皮下注射CAP(1 mg/kg)或CAPZ(15 mg/kg)，腹腔注射LPS10 mg/kg后3 h、8 h和16 h麻醉后活殺。以上各組活殺后取肺組織，－70℃保存。

2．2 ELISA法檢測(cè)肺組織細(xì)胞因子、SP及CGRP表達(dá) 取10%肺組織勻漿，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用 ELISA 法檢測(cè)肺組織 SP、CGRP、IL-6、TNF-α 和IL-10水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各因子濃度值，將濃度值除以相應(yīng)各樣本蛋白濃度值，得出各因子相對(duì)水平。

2．3 Western blotting檢測(cè)肺組織TLR4和核內(nèi)NF-κB表達(dá) 按照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肺組織核蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40μg蛋白上樣量，先進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)膜、封閉，Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育，ECL顯影，曝光。Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析，用同一目的蛋白與內(nèi)參照灰度比值表示此目的蛋白的相對(duì)含量。

2．4 肺組織病理學(xué)改變 小鼠活殺后取肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19．0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多樣本間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 內(nèi)毒素血癥組小鼠行為學(xué)改變及CAP和CAPZ的影響

正常對(duì)照組、CAP對(duì)照組和CAPZ對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，黏膜紅潤(rùn)，皮毛光滑，行動(dòng)自如。內(nèi)毒素血癥模型組則在2 h左右出現(xiàn)精神萎靡，呼吸急促，倦怠懶動(dòng)，反應(yīng)變慢，進(jìn)食減少，四肢水腫，其中下肢水腫稍重;8 h上述癥狀加重，反應(yīng)遲鈍，可見(jiàn)眼部有較多分泌物，體溫降低，四肢發(fā)抖;16 h精神更加萎靡，刺激后無(wú)反應(yīng)，眼部因分泌物較多而無(wú)法睜開(kāi)，口唇發(fā)紺，體溫較低，四肢冰冷。CAP干預(yù)組小鼠癥狀較內(nèi)毒素血癥組明顯減輕，而CAPZ干預(yù)組小鼠癥狀稍有加重。

2 CAP和CAPZ對(duì)內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響

由圖1可見(jiàn)，與同時(shí)點(diǎn)正常組比較，內(nèi)毒素血癥模型組TNF-α、IL-6和IL-10在各時(shí)點(diǎn)明顯升高(P＜0．05)，且分別在8 h、16 h 和16 h 達(dá)峰值，CAP 對(duì)照組和CAPZ對(duì)照組與之比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);與同時(shí)點(diǎn)內(nèi)毒素血癥模型組比較，CAP干預(yù)組TNF-α和IL-6在3 h、8h和16 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)明顯降低(P ＜0．05)，而其 IL-10 則在3 h、8 h和16 h 3 個(gè)時(shí)點(diǎn)明顯升高(P＜0．05)，CAPZ干預(yù)組則反之(P＜0．05)。

3 CAP和CAPZ對(duì)內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織SP和CGRP水平的影響

由表1、2可見(jiàn)，與正常組比較，內(nèi)毒素血癥組各時(shí)點(diǎn)SP和CGRP明顯升高(P＜0．05)，且均于8 h達(dá)峰值，CAP對(duì)照組和CAPZ對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)SP和CGRP也有明顯變化(P＜0．05)，但升幅不及同時(shí)點(diǎn)內(nèi)毒素血癥組及CAP干預(yù)組明顯;與同時(shí)點(diǎn)內(nèi)毒素血癥組比較，CAP干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)SP和CGRP升高明顯(P ＜0．05)，CAPZ干預(yù)組則降低明顯(P ＜0．05)。

4 內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織TLR4和NF-κB水平的變化及CAP和CAPZ的作用

與同時(shí)點(diǎn)正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織TLR4水平明顯升高(P＜0．05)，且在8 h達(dá)峰值，CAP對(duì)照組和CAPZ對(duì)照組TLR4表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);與同時(shí)點(diǎn)內(nèi)毒素血癥組相比，CAP干預(yù)組和CAPZ干預(yù)組TLR4表達(dá)水平變化不明顯(P ＞0．05)，見(jiàn)圖2、表3。

與同時(shí)點(diǎn)正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素血癥組小鼠肺組織核內(nèi)NF-κB水平明顯升高(P＜0．05)，且在8 h達(dá)峰值，CAP對(duì)照組、CAPZ對(duì)照組NF-κB無(wú)明顯變化(P＞0．05);與內(nèi)毒素血癥組比較，CAP干預(yù)組小鼠肺組織核內(nèi)NF-κB水平明顯降低(P＜0．05)，而CAPZ干預(yù)組則明顯升高(P＜0．05)，見(jiàn)圖3、表4。

5 小鼠肺組織病理學(xué)改變

光鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組、CAP對(duì)照組和CAPZ對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔內(nèi)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)無(wú)滲出;內(nèi)毒素血癥組8 h和16 h可見(jiàn)肺泡大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分肺泡萎陷，肺泡壁增寬，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺間質(zhì)見(jiàn)多形核炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);與內(nèi)毒素血癥組相比，CAP干預(yù)組肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)水腫程度明顯減輕;CAPZ干預(yù)組無(wú)明顯加重，見(jiàn)圖4。

Figure 1．Changes of cytokines in the lung tissue of mice at 3 h(A)，8 h(B)and 16 h(C)．Mean ± SD．n=6．*P ＜0．05 vs normal control group;#P ＜0．05 vs endotoxemia group．圖1 不同時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織細(xì)胞因子的變化

表1 不同時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織SP水平變化Table 1．Changes of substance Pin the lung tissue of mice at different time points［ng/(g protein)．Mean ±SD．n=6］

表2 各時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織CGRP水平變化Table 2．Changes of CGRPin the lung tissue of mice at different time points［ng/(g protein)．Mean ± SD．n=6］

Figure 2．Changes of TLR4 protein in the lung tissue of mice at different time points．圖2 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠肺組織TLR4水平變化

表3 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠肺組織TLR4相對(duì)表達(dá)量的變化Table 3．Changes of TLR4 protein relative quantity in the lung tissue of mice at different time points(Mean±SD．n=6)

Figure 3．Changes of NF-κB protein in the lung tissue of mice at different time points．圖3 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠肺組織NF-κB表達(dá)變化

表4 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠肺組織NF-κB相對(duì)表達(dá)量的變化Table 4．Changes of NF-κB protein relative quantity in the lung tissue of mice at different time points(Mean±SD．n=6)

Figure 4．Pathological changes of the lung tissue of mice in different groups(HE staining，×200)．A:normal control;B:CAP control;C:CAPZ control;D:endotoxemia;E:CAPtreatment;F:CAPZ treatment．圖4 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變

討 論

TRPV1是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，可被辣椒素激活，也可被脂質(zhì)、質(zhì)子、陽(yáng)離子、有害熱等激活［7］，主要定位于分泌SP和CGRP的感覺(jué)神經(jīng)纖維(C和Aδ)，CAP是其激動(dòng)劑，而CAPZ是其拮抗劑。TRPV1作為傷害性刺激感受器，激活時(shí)炎癥或骨癌中的疼痛反應(yīng)會(huì)加重。目前，有人用不同劑量CAP干預(yù)大鼠膿毒癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量CAP可降低膿毒癥大鼠 TNF-α和 IL-6，升高 IL-10，而大劑量CAP則可使大鼠膿毒癥加重［6］，本文采用了小劑量CAP干預(yù)內(nèi)毒素血癥小鼠，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)了NF-κB和TLR4水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRPV1激活后明顯降低內(nèi)毒素血癥小鼠TNF-α和IL-6水平，升高IL-10，而TRPV1拮抗后效果與之相反，這在正反兩方面說(shuō)明TRPV1激活后可減輕內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織炎癥反應(yīng)程度，減少肺損傷。CAP對(duì)照組以及CAPZ對(duì)照組炎癥因子水平較正常對(duì)照組無(wú)顯著變化，這說(shuō)明TRPV1在正常狀態(tài)下不能影響以上炎癥因子的表達(dá)。但與此同時(shí)，TRPV1激活后可調(diào)節(jié)NF-κB水平卻不能調(diào)節(jié)TLR4水平，這說(shuō)明TRPV1在內(nèi)毒素血癥中的調(diào)節(jié)作用不是通過(guò)TLR4實(shí)現(xiàn)的。而先前Diogenes等［8］也發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激三叉神經(jīng)可激活TRPV1受體，但用TLR4拮抗劑阻斷TLR4后，TRPV1無(wú)法被激活，由此可以推測(cè)，TLR4可能位于TRPV1調(diào)節(jié)位點(diǎn)上游。

眾所周知，TRPV1激活后可導(dǎo)致SP和CGRP水平升高，故肺組織SP和CGRP水平可以作為T(mén)RPV1激活與否的指示劑。另外，CAP對(duì)照組的SP以及CGRP水平顯著升高，而其N(xiāo)F-κB水平變化卻不明顯，其原因可能有以下3個(gè):(1)在沒(méi)有LPS刺激情況下，NF-κB激活基礎(chǔ)量較低，可能 SP以及 CGRP的升高對(duì)其激活量變化有影響，但是幅度較低，在WB圖像上表現(xiàn)不明顯。(2)也可能SP和CGRP的對(duì)NF-κB的調(diào)控作用比較復(fù)雜，在沒(méi)有LPS刺激情況下，CAP激活所導(dǎo)致的SP以及CGRP水平較低，SP以及CGRP在水平較低情況下對(duì)NF-κB作用平衡關(guān)系較大劑量的情況不一樣，所呈現(xiàn)出來(lái)的綜合結(jié)果就是NF-κB表達(dá)沒(méi)有受到明顯影響，這需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確。(3)CAP干預(yù)組NF-κB水平變化較明顯，而CAP對(duì)照組NF-κB水平變化不明顯，可能是因?yàn)镃AP對(duì)NF-κB的作用必須在有LPS刺激的情況下才能發(fā)揮，這點(diǎn)需要通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

關(guān)于TRPV1激活影響NF-κB活化的機(jī)制尚不明確。本研究表明，膿毒癥小鼠TRPV1激活后血清SP和CGRP水平升高，而后兩者可能是參與調(diào)節(jié)NF-κB活化及炎癥反應(yīng)水平的重要物質(zhì)。Ang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，SP的升高能激活ERK1/2并誘導(dǎo)NF-κB活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。盡管這一作用機(jī)制不能解釋我們研究結(jié)果，但揭示了SP可能是TRPV1激活后影響NF-κB活化的可能機(jī)制。另有研究顯示，CGRP可降低膿毒癥小鼠血清TNF-α水平、提高IL-10和IL-6水平［10］，且可抑制朗格漢斯細(xì)胞中NF-κB的激活［11］，可見(jiàn)CGRP也參與了 TRPV1激活影響 NF-κB活化的過(guò)程。然而，盡管TRPV1的激活后可促進(jìn)血清SP水平的升高，但同時(shí)TRPV1激活可導(dǎo)致生長(zhǎng)抑素的釋放［12］，而后者卻可抑制 SP 的釋放［13］，由此可見(jiàn)，TRPV1激活后SP水平受到雙向調(diào)控。所以，TRPV1激活后可能SP及CGRP影響NF-κB活化及炎癥反應(yīng)，但是TRPV1激活對(duì)SP及CGRP的調(diào)控非常復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，內(nèi)毒素血癥小鼠TRPV1激活可能通過(guò)SP及CGRP影響NF-κB水平并降低肺組織炎癥因子水平，減輕肺部炎癥損傷，這為膿毒癥肺損傷治療提供了新思路和靶標(biāo)。