miR-155-5p在宮頸癌血清中的表達及其對宮頸癌細胞的影響*

車玉傳， 蘇運欽， 溫旺榮

(暨南大學附屬第一醫院臨床醫學檢驗中心，廣東廣州510630)

宮頸癌是世界女性中僅次于乳腺癌和結直腸癌的第3個常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康和生命，因此對宮頸癌的早期診斷具有重要意義。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近年來熱點研究的一類高度保守的內源性、非編碼單鏈小分子RNA，主要通過與特定靶基因mRNA的3'端非翻譯區(untranslated region，UTR)完全或不完全互補配對而在轉錄后水平負調控靶基因表達。近年來研究發現，部分miRNA的異常表達與宮頸癌發生和發展密切相關［1-4］。miR-155-5p是最早發現的具有促癌活性的 miRNA，在宮頸癌［5］、子宮內膜癌［6］、乳腺癌［7］、大腸癌［8］、胰腺癌［9］、肺癌［10］等惡性腫瘤組織中表達上調，并與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。血清中也存在miR-155-5p，其能夠對抗核糖核酸酶的降解而保持穩定性，然而miR-155-5p在宮頸癌患者血清中的表達及功能研究尚未見報道，本研究擬采用實時熒光定量PCR方法檢測miR-155-5p在宮頸癌患者血清中的表達情況，并通過miR-155-5p mimic或inhibitor上調或抑制宮頸癌細胞miR-155-5p的表達，觀察miR-155-5p對宮頸癌細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響，了解miRNA在宮頸癌發生發展中的作用機制，探討miR-155-5p在宮頸癌早期診斷和治療中的臨床應用價值。

材料和方法

1 研究對象

收集暨南大學附屬第一醫院2012年1月至2013年5月初診的宮頸癌患者15例，宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)患者15例和慢性宮頸炎患者12例，收集同期體檢的健康對照女性血清標本15例。排除標準:非初診患者，即已接受過手術、放療、化療等不同治療的患者;伴有心、肝、腦、腎、肺等器官及血液系統疾病。所有血清標本收集立即置于－80℃冰箱保存。宮頸癌HeLa和SiHa細胞由中山大學附屬腫瘤醫院實驗中心饋贈。

2 主要儀器

LightCycler 1．5 Instrument(Roche);Prism 7000熒光定量 PCR儀 (ABI);熒光倒置顯微鏡(Olympus);Biophotometer生物分光光度計(Eppendorf);高速冷凍離心機(Eppendorf);酶標儀(Bio-Rad);凝膠成像系統(Alpha);生物安全柜(ESCO)。

3 主要試劑

miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技有限公司);脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen);Trizol試劑(Invitrogen);逆轉錄試劑盒與SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa);miR-155-5p及內參照U6 snRNA特異逆轉錄及qRTPCR引物、miR-155-5p mimic和 inhibitor(廣州市銳博生物科技有限公司);DMEM高糖培養基(Gibco);1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素溶液(Gibco);無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);無血清培養基 Opti-MEMⅠ(Gibco);CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學研究所);細胞周期檢測試劑盒(Sigma);凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司);其它常規化學試劑均為分析純產品。

4 血清miRNA和細胞總RNA的提取

4．1 血清 miRNA提取 取450μL血清，嚴格按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作提取，將提取的miRNA用15μL DEPC處理水溶解，－80℃保存備用。

4．2 細胞總RNA提取 常規Trizol法提取細胞的總RNA。加入50μL DEPC水溶解RNA，反復吹打混勻，65℃烤箱助溶10 min，冰上冷卻5 min，－80℃保存備用。

4．3 RNA純度及濃度的測定 取10μL總RNA，加0．1%DEPC 處理水 90μL稀釋 10倍，以 0．1%DEPC處理水做空白對照，超微量紫外分光光度計測定RNA在波長260 nm與280 nm的吸光度值，RNA溶液的A260/A280在1．8～2．1為純度合格。樣品RNA濃度(mg/L)=A260×40×樣本稀釋倍數。

5 實時熒光定量PCR檢測miR-155-5p的表達

5．1 miR-155-5p逆轉錄反應 反應體系為10μL，包括5 × PrimeScript? Buffer 2 μL，PrimeScript? RT Enzyme Mix I 0．5 μL，特異性逆轉錄引物(5 μmol/L)0．2 μL，總 RNA 5 μL，RNase-Free dH2O 2．3 μL。反應條件為42℃ 15 min，85℃ 5 s。內參照U6 snRNA逆轉錄反應參數同上。反應設1復孔。逆轉錄產物cDNA保存于－20℃冰箱備用。

5．2 miR-155-5p qRT-PCR 反應體系為20μL，包括SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各1．6 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0．4 μL，cDNA 模板2 μL，0．1%DEPC處理水4．4μL。反應條件:95℃預變性30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40個循環。陰性對照以0．1%DEPC處理水代替逆轉錄產物。設置熔解曲線判斷是否存在引物二聚體和非特異性擴增。內參照U6 snRNA qRT-PCR參數同上。

6 細胞株的培養及轉染

HeLa和SiHa細胞株接種于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養基，37℃、5%CO2條件下培養。實驗時取對數生長期細胞，以(2～4)×105cells/well種6孔板。轉染前1 d，每孔中加入1 000μL不含抗生素的培養基繼續培養，細胞生長至70% ～90% 融合度時，嚴格按照LipofectamineTM2000和廣州銳博生物科技有限公司miR-155-5p mimic和inhibitor使用說明書的條件進行轉染。轉染4 h后，更換新鮮的完全培養基，37℃、5%CO2條件下繼續培養。miR-155-5p mimic轉染分6組:空白組、脂質體組、50 nmol/L mimic組、100 nmol/L mimic組、200 nmol/L mimic組和negative control組。miR-155-5p inhibitor轉染分5組:空白組、脂質體組、100 nmol/L inhibitor組、200 nmol/L inhibitor組和negative control組。陰性對照是經過生物信息學分析與人miRNA具有最小同源性的線蟲miRNA，適用于人miRNA實驗的陰性對照。各自陰性對照終濃度為100 nmol/L。

7 CCK-8法檢測各組細胞的增殖情況

按前述方法將miR-155-5p mimic和inhibitor轉染HeLa和SiHa細胞24 h后，經胰酶消化收集細胞，在離心管內將各組細胞懸液充分打勻，按HeLa細胞3×104cells/well、SiHa細胞 2 ×104cells/well接種于96孔板中，每孔加液量100μL，37℃、5%CO2條件下繼續培養。于 24 h、48 h、72 h、96 h，每組分別取 3個平行孔進行檢測，將培養液去除，每孔加入100μL無血清培養基和10μL CCK-8試劑，在37℃、5%CO2條件下繼續培養1 h后，用酶標儀檢測波長為490 nm時的吸光度(A)。

8 流式細胞術檢測miR-155-5p對宮頸癌HeLa和SiHa細胞周期和凋亡的影響

8．1 PI單染法檢測宮頸癌HeLa和SiHa細胞周期 以適量胰酶消化、收集轉染48 h后的宮頸癌細胞，2 000 r/min離心5 min，并用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌、重懸細胞2次，棄上清，加入預冷的70%乙醇2 mL，混勻，于4℃固定過夜。第2天以1 500 r/min離心5 min收集細胞，1 000μL預冷磷酸緩沖液再次洗滌后加入400μL 50 mg/L碘化丙啶(propidium iodide，PI)和100μL 100 mg/L RNase A，4℃ 避光孵育30 min，以50μm尼龍網膜過濾細胞，流式細胞術檢測細胞DNA含量。結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。每組重復3次。

8．2 Annexin V/PI雙染法檢測宮頸癌HeLa和SiHa細胞凋亡 以適量不含EDTA胰酶消化、收集轉染48 h后的宮頸癌HeLa和SiHa細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌、重懸細胞2次。以2 000 r/min離心5 min，收集(1～5)×105個細胞，離心沉淀，加入 500μL binding buffer懸浮細胞，向懸液中加入5μL Annexin V-FITC混勻染色，隨后加入5μL PI混勻染色，室溫下避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

9 數據處理與統計學分析

qRT-PCR以U6 snRNA為內參照，對目標基因進行歸一化處理。采用相對定量法，樣品目的基因的相對定量(relative quantification，RQ)采用 ΔΔCt方法計算，ΔCt待測樣本=(CT樣本miR-155-5p－ Ct樣本U6snRNA)的均 數 ± 標 準 差，ΔCt對照樣本= (Ct對照miR-155-5p－Ct對照U6snRNA)的均數 ± 標準差，ΔΔCt=(ΔCt待測樣本－ΔCt對照樣本)±標準差。RQ=2－ΔΔCt的均數 ± 標準差，表示實驗組miR-155-5p相對于對照組的相對表達量。

數據均采用SPSS 13．0統計軟件處理，miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對照組血清中的相對表達量 2－ΔΔCt經單樣本 Kolmogorov-Smimov檢驗，符合正態分布(Z=1．064，P=0．208 ＞0．10)，以均數±標準差(mean±SD)表示。經Levene法檢驗符合方差齊性條件(P=0．313＞0．10)，因此兩個樣本均數比較采用Independent-Sample T test進行檢驗，多個樣本均數比較采用One-way ANOVA分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 實時熒光定量PCR熔解曲線

miR-155-5p和U6 snRNA的熔解曲線為單峰，未見雜峰信號，表明引物擴增的特異性較好，產物單一，無明顯非特異產物。miR-155-5p和U6 snRNA的熔解溫度非常接近，在82℃左右，見圖1。血清miR-155及U6 snRNA擴增曲線呈標準S型。陰性對照產生的微弱非特異擴增信號明顯滯后于實驗組血清樣本的擴增信號。

2 miRNA的cDNA擴增及電泳檢測鑒定

對miR-155-5p和內參照U6 snRNA的2次擴增產物用4%瓊脂糖凝膠電泳，在100 bp左右出現明顯的亮帶，且與所推斷的目的片段大小范圍大致相符，為有效擴增。產物條帶單一，無非特異性擴增條帶，見圖2。

Figure 1．Melting curves for miR-155-5p and U6 snRNA．圖1 miR-155-5p和U6 snRNA熔解曲線

Figure 2．Electrophoresis results for miR-155-5p and U6 snRNA PCR products．M:TaKaRa 20 bp DNA ladder marker;1～3:U6 snRNA amplification products;4～6:miR-155-5p amplification products;NC1:U6 snRNA negative control;NC2:miR-155-5p negative control．圖2 miR-155-5p和U6 snRNA擴增產物電泳

表1 miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對照組血清中的表達差異Table 1．Differential expression of serum miR-155-5p in cervical cancer，CIN，cervicitis and healthy control group(Mean±SD)

Figure 3．The red fluorescence distribution of HeLa cells and SiHa cells 24 h after transfection(×100)．A:HeLa cells，phase-contrast;B:HeLa cells，fluorescence;C:SiHa cells，phase-contrast;D:SiHa cells，fluorescence．圖3 HeLa細胞和SiHa細胞紅色熒光分布

3 miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對照組血清中的表達差異情況

qRT-PCR檢測miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對照組血清樣本中相對于U6 snRNA的表達。經 One-way ANOVA檢驗，可認為4組血清中miR-155-5p的相對表達量不同(P＜0．05)。經多個樣本均數間兩兩比較的SNK檢驗，宮頸癌組血清中miR-155-5p的相對表達量高于宮頸炎組和健康對照組(P＜0．05)，CIN組和宮頸癌組血清中miR-155-5p的相對表達量差異無統計學意義(P＜0．05)，CIN組、宮頸炎組和健康對照組血清中miR-155-5p的相對表達量差異也無統計學意義(P＞0．05)，見表1。

4 宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞轉染效率觀察

轉染前1 d，接種適當數量的細胞至6孔板中，每孔中加入1 mL不含抗生素的培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到70% ～90%。以100 nmol/L終濃度將帶Cy3標記的miRNA mimic陰性對照轉染HeLa細胞和SiHa細胞。轉染后24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察并計數紅色熒光細胞的百分比例，結果顯示95%以上的HeLa細胞和SiHa細胞內可見紅色熒光分布，細胞轉染效率可達95%以上，見圖3。

5 miR-155-5p mimic和inhibitor轉染HeLa和Si-Ha細胞后miR-155-5p表達量的變化

轉染miR-155-5p mimic后，2種細胞中miR-155-5p相對表達量明顯上調，且隨著時間的推移，miR-155-5p mimic在細胞內的降解逐漸加快，但其上調miR-155-5p的作用至少可以持續到轉染后96 h，見表2。miR-155-5p mimic在SiHa細胞中的降解速度比在HeLa細胞中快。由于miR-155-5p inhibitor競爭性抑制的作用機制，即與miR-155-5p高效穩定結合，減弱內源性miR-155-5p對下游靶基因的調控作用，所以對細胞內miR-155-5p相對表達量的下調并不明顯，見表3。

表2 miR-155-5p mimic轉染細胞后miR-155-5p表達量的動態性改變Table 2．The expression changes of miR-155-5p after transfected with miR-155-5p mimic(2 －ΔΔCt)

表3 miR-155-5p inhibitor轉染細胞后miR-155-5p表達量的動態性改變Table 3．The expression changes of miR-155-5p after transfected with miR-155-5p inhibitor(2 －ΔΔCt)

6 miR-155-5p對宮頸癌HeLa和SiHa細胞增殖的影響

從圖4、5可見，用CCK-8法檢測miR-155-5p表達的上調或下調對轉染后不同時點細胞增殖的影響發現，與空白細胞組、脂質體組、陰性對照組相比，分別以 50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 轉染 miR-155-5p mimic和以 100 nmol/L、200 nmol/L轉染miR-155-5p inhibitor，HeLa細胞和SiHa細胞在轉染后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖差異均無統計學意義(P＞0．05)，無時間和劑量依賴性。

Figure 4．The growth curves of HeLa and SiHa cells after transfected with miR-155-5p mimic．Mean ±SD．n=3．圖4 miR-155-5p mimic轉染后HeLa和SiHa細胞生長曲線

Figure 5．The growth curves of HeLa and SiHa cells after transfected with miR-155-5p inhibitor．Mean ± SD．n=3．圖5 miR-155-5p inhibitor轉染后HeLa和SiHa細胞生長曲線

7 miR-155-5p對宮頸癌HeLa和SiHa細胞周期和凋亡的影響

用Levene法進行方差齊性檢驗，不同組別HeLa和SiHa不同細胞周期階段和凋亡的百分率符合方差齊性條件(P＞0．10)。經完全隨機設計資料的方差分析，發現轉染不同濃度miR-155-5p mimic對Si-Ha細胞凋亡的影響不同(P＜0．05)。與空白組、脂質體組和陰性對照組相比，轉染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p mimic的SiHa細胞中，S期細胞比例升高，凋亡細胞比例降低(P＜0．05)。與空白組、脂質體組和陰性對照組相比，轉染50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p mimic以及轉染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p inhibitor對HeLa細胞的細胞周期和凋亡的影響差別均無統計學意義(P＞0．05)。另外，轉染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p inhibitor的 SiHa細胞中，G2/M期細胞比例明顯增高(P＜0．05)，下調SiHa細胞miR-155-5p表達可能誘導G2/M期阻滯。轉染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p inhibitor對SiHa細胞凋亡的影響與空白組、脂質體組和陰性對照組相比，差別也均無統計學意義(P＞0．05)，見表4、5。

表4 miR-155-5p mimic對HeLa和SiHa細胞周期和凋亡的影響Table 4．The effects of miR-155-5p mimic on cell cycle and apoptosis of HeLa and SiHa cells 48 h after transfection(%．Mean±SD．n=3)

表5 miR-155-5p inhibitor對HeLa和SiHa細胞周期和凋亡的影響Table 5．The effects of miR-155-5p inhibitor on cell cycle and apoptosis of HeLa and SiHa cells 48 h after transfection(%．Mean±SD．n=3)

討 論

miRNA是一種內源性轉錄后調控因子，在mRNA水平調節靶基因的表達。血清miRNA主要來源于凋亡或壞死的細胞、組織細胞的主動分泌以及循環細胞的裂解。因此，miRNA在血清和組織中的表達具有較高的相似性。內源性血清miRNA多數不是以游離形式存在，成熟后常與蛋白等構成沉默復合體，因被蛋白保護而具有良好的抗RNase降解能力，盡管血清中miRNA豐度較組織中低得多，但是miRNA在血清中高度穩定，這一特點為血清miRNA發揮生物學功能、作為腫瘤標志物提供了基礎［11］。

宮頸癌相關miRNA異常表達的臨床應用研究已成為熱點。多種miRNA的異常表達與宮頸癌的發生、發展密切相關［12］。通過對宮頸癌相關miRNA進行鑒定和功能分析，發現宮頸癌中有明確靶基因的 miRNA 差異表達譜，如 miR-21、miR-29、miR-34、miR-143、miR-214、miR-372、miR-519、miR-17-5p 等，可能用于監測宮頸癌發生、發展。另外，Ke等［13］發現，相比于對放射治療較敏感的宮頸癌組織和細胞，在對放射治療不敏感宮頸癌組織和細胞，miR-181a表達上調。進一步功能研究發現過表達miR-181a能靶向負調控促凋亡蛋白激酶PRKCD(protein kinase C delta)基因的表達，抑制輻射誘導的細胞凋亡和減少G2/M阻滯，進而抑制宮頸癌細胞放療敏感性，相反下調miR-181a能增加宮頸癌細胞PRKCD的表達，進而提高宮頸癌細胞放療敏感性。因此，宮頸癌miR-181a表達水平可為評價宮頸癌患者放療敏感性提供有價值的參考指標，同時靶向結合抑制miR-181a可能是增強宮頸癌放射治療敏感性的一種新方法。

本文研究的miR-155-5p定位于人染色體21q21，由 B細胞整合簇(B-cell integration cluster，BIC)基因第3個外顯子高度保守區編碼，在宮頸癌［5］、子宮內膜癌［6］、乳腺癌［7］、大腸癌［8］、胰腺癌［9］、肺癌［10］等惡性腫瘤組織中表達上調，并與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。本實驗采用Stem-Loop SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR法檢測血清、HeLa和SiHa細胞中miR-155-5p的表達水平，設計具有莖環結構的特異性逆轉錄引物，只檢測成熟的miR-155-5p，并且能延長逆轉錄產物cDNA，解決了因miRNA片段短而難于檢測的問題。熔解曲線和擴增產物的電泳分析結果證明了反應的特異性。

本研究發現宮頸癌患者血清中miR-155-5p相對于慢性宮頸炎和健康對照者表達升高，與李莉等［14］、Wang等［15］等在宮頸癌組織中發現miR-155-5p高表達相一致，說明miR-155-5p在宮頸癌患者血清和組織中的表達具有較高的相似性，miR-155-5p可能參與宮頸組織的惡變進程，但在宮頸癌患者血清中miR-155-5p的豐度較低。另外，血清miR-155-5p含量在宮頸癌與CIN組之間無統計學差異，是否與樣本例數有關有待進一步證實。實驗用Cy3標記的100 nmol/L miR-155-5p mimic陰性對照轉染HeLa和SiHa細胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染率，95%以上細胞可見紅色熒光。本研究采用qPCR檢測轉染不同濃度miR-155-5p mimic和inhibitor后HeLa和SiHa細胞中miR-155-5p的相對表達量，證實miR-155-5p mimic能有效上調miR-155-5p的表達。miR-155-5p mimic是運用化學方法合成的雙鏈RNA，能模擬細胞中內源性成熟miR-155-5p的高水平表達，以增強內源性miR-155-5p的調控作用，進行功能獲得性研究。相反，由于miR-155-5p inhibitor競爭性抑制的作用機制，即通過與成熟miR-155-5p分子特異性結合，削弱內源性miR-155-5p的基因調控作用，進行功能缺失性研究，所以對HeLa和SiHa細胞內miR-155-5p的表達量的下調并不明顯。本研究采用CCK-8法檢測細胞增殖，與常用的MTT法相比，還原后的Formazan是水溶性的，不需要添加有機溶劑溶解，步驟少，重復性好，是一種更加簡便而準確的細胞增殖和毒性檢測方法，為進一步研究相關miRNA的體內抗腫瘤作用奠定了基礎。本實驗通過CCK-8法檢測發現miR-155-5p對人宮頸癌HeLa和SiHa細胞的增殖無明顯作用，呈非時間劑量依賴方式。流式細胞術檢測miR-155-5p mimic處理后SiHa細胞，發現S期細胞比例增多，且表現出對細胞凋亡的抑制作用，呈非劑量依賴方式，但與CCK-8檢測細胞增殖結果不一致。分析其原因，可能與miR-155-5p mimic在細胞內環境中不穩定，容易被降解有關;也可能與細胞周期和凋亡信號通路網絡的互補作用有關。進一步的研究應該通過構建miR-155-5p前體高表達載體或miR-155-5p抑制劑表達載體，能較長時間維持miR-155-5p在細胞內的高水平或抑制狀態，以進行miRNA功能獲得性或缺失性研究。miR-155-5p inhibitor對SiHa細胞的作用主要表現為G2/M期細胞比例增多，G2/M期阻滯使細胞無法進入下一增殖周期，且呈非劑量依賴方式，這可能是其抗腫瘤機制的另一方面。另外，miR-155-5p對HeLa細胞和SiHa細胞周期和凋亡的影響不同，分析其差異的原因可能與miR-155-5p在HeLa細胞和SiHa細胞中的含量不同有關，前期研究發現miR-155-5p在SiHa細胞中的表達要比HeLa細胞高。

miR-155-5p在宮頸癌患者組織、細胞和血清中表達的上調受上游哪些因素調控，以及下游調控哪些信號通路中的哪種靶基因是下一步重點研究方向。此次miR-155-5p與宮頸癌的相關性研究僅為初步探討，樣本量較小，有待增加樣本量進一步研究，為宮頸癌的早期診斷以及判斷miR-155-5p是否可能作為“癌基因”參與宮頸癌的發生、發展提供更有力的實驗依據。