IQGAP1在人骨髓瘤細(xì)胞中過表達(dá)且與ERK相互作用*

馬泳泳， 黃 進(jìn)， 周淑娟， 葛杭萍， 俞 康

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，浙江溫州325000;2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科，湖南長(zhǎng)沙410000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞惡性克隆增生性疾病，是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤［1］。目前仍不可治愈。傳統(tǒng)化療和自體干細(xì)胞移植可使患者得到暫時(shí)緩解，但往往短期復(fù)發(fā)并產(chǎn)生耐藥。目前臨床涌現(xiàn)一些新藥［2］，在治療中取得了顯著的抗骨髓瘤效應(yīng)，但仍未改變MM不可治愈的現(xiàn)狀，需要從分子生物學(xué)水平進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制。

多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制涉及染色體易位、細(xì)胞因子異常、骨髓微環(huán)境改變以及信號(hào)通路異常等［3-4］。膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Ras/Raf/MEK/MAPK通路)是其發(fā)病機(jī)制的重要信號(hào)通路［5］。

含IQ模序的GTP酶活化蛋白1(IQmotif-containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1)是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族，其基因位于染色體15q26上，是基因擴(kuò)增熱點(diǎn)，其所在位點(diǎn)基因變異和表達(dá)增加，已在多種腫瘤組織和不同腫瘤細(xì)胞株中被觀察到［6-8］。IQGAP1 蛋白結(jié)合 Ras/Raf/MEK/MAPK 通路上多個(gè)蛋白成分，最近有研究證實(shí)抑制胰腺癌及黑色素瘤患者IQGAP1蛋白表達(dá)可實(shí)現(xiàn)RAF/MEK/ERK 途徑的阻斷［9］。

IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞中是否表達(dá)增高?目前尚無此類報(bào)道。其機(jī)制是否類似其在胰腺癌及黑色素瘤患者的機(jī)制——通過與RAF/MEK/ERK途徑上ERK結(jié)合實(shí)現(xiàn)?本文就IQGAP1在人骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226和U266細(xì)胞中的表達(dá)及其機(jī)制進(jìn)行研究。

材料和方法

1 主要藥品和試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液為 Gibco產(chǎn)品。胎牛血清(fetal calf serium，F(xiàn)CS)購(gòu)自杭州四季青生物公司。TRIzol購(gòu)自Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 Fermentas。白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)購(gòu)自北京天象邦定公司。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購(gòu)自 PeproTech。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2、蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)、p-Akt、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducers and activator of transcription 3，STAT3)、p-STAT3和 β-actin購(gòu)自 Cell Signaling technology。OneStep RT-PCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品。MTT購(gòu)自Sigma。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 引物序列Table1．Sequencesfor primers

2 主要方法

2．1 細(xì)胞株的培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株 RPMI8226和U266由溫州醫(yī)學(xué)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)前從－196℃液氮罐中取出，快速?gòu)?fù)蘇后用含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2．2 RT-PCR檢測(cè)RPMI8226和U266細(xì)胞IQGAP1 mRNA的表達(dá) 各收集骨髓瘤細(xì)胞U266和RPMI8226，細(xì)胞密度為4×109/L。使用shRNA表達(dá)質(zhì)粒沉默 RPMI8226細(xì)胞 IQGAP1(clone 1、clone 2、clone 3和 clone 4)，收集骨髓瘤細(xì)胞，同時(shí)設(shè) RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組。

采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照One Step RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積50．0μL，其中5× One-Step RT-PCR buffer 10．0 μL，dNTP Mix 2．0 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2．0 μL，5 × Q-Solution 10．0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1．0 μg，引物0.6μmol/L。其退火溫度為54℃。然后，取 RTPCR產(chǎn)物10．0 μL，加上樣緩沖液 2．0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析目的基因與β-actin基因條帶吸光度比值。

2．3 Western blotting檢測(cè)IQGAP1蛋白及ERK1/2、Akt、STAT3總蛋白及磷酸化蛋白水平

收集正常淋巴細(xì)胞、RPMI8226和U266骨髓瘤細(xì)胞各4×109/L，PBS清洗后加入蛋白抽提裂解液50μL抽提細(xì)胞總蛋白，冰浴15 min，離心收集細(xì)胞總蛋白。蛋白提取物經(jīng)定量后，30μg上樣至8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，檢測(cè)IQGAP1表達(dá)。

使用shRNA表達(dá)質(zhì)粒沉默RPMI8226細(xì)胞IQGAP1(clone 1、clone 2、clone 3 和clone 4)，收集骨髓瘤細(xì)胞，抽提蛋白，同時(shí)設(shè)RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組，檢測(cè)IQGAP1表達(dá)過程同上步。

收集 RPMI8226-shIQGAP1組 (clone 1)、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，抽提蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜后后者經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，分別與1∶500稀釋度的相應(yīng)Ⅰ抗(抗p-ERK1/2抗體、抗ERK1/2抗體、抗 Akt抗體、抗 p-Akt抗體、抗STAT3抗體和抗p-STAT3抗體)和適宜稀釋度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育，經(jīng)Odyssey顯色系統(tǒng)顯色，收集蛋白印跡圖。

2．4 沉默IQGAP1 特異性沉默人IQGAP1的shRNA質(zhì)粒(KH0073P)購(gòu)自Bioscience。寡核苷酸序列如下:5'-CAACGACATTGCCAGGGATAT-3'(clone 1);5'-AAACTGACCCTGTGGATATTT-3'(clone 2);5'-ACAGATTCCTGCAGCTAAACT-3'(clone 3);5'-GCATGCTGCAGCTAAACT-3' (clone 4);5'-GGAATCTCATTCGATGCATAC-3'(陰性對(duì)照)。RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)，轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入500 mg/L G418篩選，經(jīng)2周后形成陽(yáng)性克隆，將克隆轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并傳代建系，分別命名為 clone 1-、clone 2-、clone 3-、clone 4-RPMI8226-shIQGAP1和陰性對(duì)照細(xì)胞。

2．5 MTT增殖抑制實(shí)驗(yàn) 以每孔2×108/L的細(xì)胞密度接種于96孔板中，200μL/well;分3組:VEGF組(VEGF濃度為20．0 ng/L)、IL-6組(IL-6濃度為20．0 ng/L)和無VEGF/IL-6組;各組再分為3個(gè)亞組:RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組。經(jīng)12、24和48 h后每孔加入MTT(濃度為5 g/L)20μL，37℃放置4 h;離心，棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，混勻吹打，使沉淀充分溶解;用酶聯(lián)免疫分析儀讀取490 nm處的吸光度(A)，并用以下公式計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。增殖抑制率(%)=(1－藥物組A值/對(duì)照組A值)×100%。

2．6 免疫共沉淀 將 RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組3組細(xì)胞(每組約1×107個(gè)細(xì)胞)用RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min(r=8．5 cm)離心15 min收集蛋白上清;Bradford法對(duì)蛋白定量后，調(diào)蛋白濃度成一致;用相應(yīng)Ⅰ抗免疫沉淀目標(biāo)蛋白，4℃旋轉(zhuǎn)過夜;然后用25μL瓊脂糖珠子捕獲免疫沉淀復(fù)合物，4℃反應(yīng)3 h;RIPA洗滌沉淀復(fù)合物3遍，3×SDSloading緩沖液重懸沉淀，煮沸后使蛋白變性;離心收集樣品上清，－80℃保存或進(jìn)一步用Western blotting檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，U266和RPMI8226骨髓瘤細(xì)胞中IQGAP1 mRNA和蛋白表達(dá)增高，與正常淋巴細(xì)胞比較有顯著差異，見圖1。

2 shRNA沉默后IQGAP1 mRNA和蛋白的表達(dá)

RT-PCR及Western blotting結(jié)果顯示，RPMI8226-shIQGAP1(clone 1～4)組的IQGAP1 mRNA和蛋白較RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

3 ERK1/2、Akt和STAT3總蛋白及其磷酸化蛋白水平

與RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組比較，RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組ERK1/2磷酸化水平下降70．2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而3組Akt和STAT3蛋白的磷酸化水平無明顯差別，見圖3。

Figure 1．IQGAP1 was overexpressed in human myeloma cell lines．A:RT-PCR showed the mRNA expression of IQGAP1 in two human myeloma cell lines(U266 and RPMI8226)and the control(normal lymphocytes);B:Western blotting showed the protein expression of IQGAP1 in two human myeloma cell lines(U266 and RPMI8226)and the control(normal lymphocytes)．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control．圖1 IQGAP1在人骨髓瘤細(xì)胞株中過表達(dá)

Figure 2．Effects of shRNA on the expression of IQGAP1 in human myeloma cell line RPMI8226．A:RT-PCR showed the mRNA expression of IQGAP1 in RPMI8226-shIQGAP1，RPMI8226-shRNA negative control and un-transfected RPMI8226 cells;B:Western blotting showed the protein expression of IQGAP1 in RPMI8226-shIQGAP1，RPMI8226-shRNA negative control and un-transfected RPMI8226 cells．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs RPMI8226-shRNA negative control and un-transfected RPMI8226．圖2 轉(zhuǎn)染shRNA后IQGAP1在人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226中的表達(dá)

Figure 3．Effects of shRNA knockdown of IQGAP1 on phosphorylation of the proteins in different signal transduction pathways in human myeloma cell line RPMI8226．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs other groups．圖3 RPMI8226-shIQGAP1、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照和未轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞的各通路蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)

4 MTT結(jié)果

沉默RPMI8226細(xì)胞IQGAP1 12、24和48 h后用 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組較RPMI8226-shRNA陰性轉(zhuǎn)染組和RPMI8226細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組明顯下降，差異顯著(P＜0.05)。VEGF共培養(yǎng)、IL-6共培養(yǎng)和無VEGF/IL-6共培養(yǎng)的3個(gè)亞組在12、24和48 h及RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性轉(zhuǎn)染組和RPMI8226細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組間無明顯差異，見圖4。

5 免疫共沉淀結(jié)果

免疫共沉淀使用抗IQGAP1抗體，Western blotting檢測(cè)使用抗ERK1/2抗體。在RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組無 ERK1/2蛋白表達(dá)，而 RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組均有IQGAP1和ERK1/2蛋白表達(dá)，見圖5。

Figure 4．Effects of shRNA knockdown of IQGAP1 on the proliferation of human myeloma cell line RPMI8226．A:12 h;B:24 h;C:48 h．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs other groups．圖4 RPMI8226-shIQGAP1、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照和未轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞的增殖活性

討 論

多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制涉及染色體易位、細(xì)胞因子異常、骨髓微環(huán)境改變以及信號(hào)通路異常等。Ras-MAP通路是細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素等廣泛涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此通路的持續(xù)激活與人類多種腫瘤尤其是造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。ras癌基因及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MM的發(fā)病中起著重要作用，有ras突變的MM患者其生存期更短且對(duì)化療不敏感。多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子如IL-6［10-11］、胰島素樣生長(zhǎng)因子I和VEGF等均能激活此通路，并通過整合素實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間相互聯(lián)系，共同調(diào)控MM細(xì)胞的生長(zhǎng)與耐藥性。

Figure 5．IQGAP1-ERK interaction in human myeloma cell line RPMI8226．圖5 在人骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226中IQGAP1與ERK相互作用

IQGAPs是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白家族，其序列中含有類似于GTP酶催化域的廣泛序列和位于N端的4個(gè)可與鈣調(diào)蛋白相互作用的IQ模序，在哺乳動(dòng)物中有3個(gè)同源物即IQGAP1～3。

IQGAP1是3個(gè)人類IQGAP同系物中發(fā)現(xiàn)最早的［12］，不同于IQGAP2和IQGAP3限制性表達(dá)于肝和腸道等器官，其呈現(xiàn)出一種全身性地表達(dá)［13-14］。IQGAP1是Rho家族GTP酶成員Rac1和cdc42的一個(gè)重要效應(yīng)因子，能與細(xì)胞骨架和黏附成分廣泛作用［15］，通過調(diào)節(jié)MAPK途徑，可以影響細(xì)胞增殖和分化，在細(xì)胞黏附和遷移的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16］。IQGAP1基因位于染色體15q26上，是基因擴(kuò)增熱點(diǎn)，其所在位點(diǎn)基因變異和表達(dá)增加已在多種腫瘤組織和不同腫瘤細(xì)胞株中被觀察到［17］，如乳腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等。

本研究用 RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，U266及 RPMI82262骨髓瘤細(xì)胞 IQGAP1 mRNA表達(dá)增高，Western blotting檢測(cè)2種細(xì)胞中的IQGAP1蛋白表達(dá)增高，與正常淋巴細(xì)胞比較差異顯著;而用shRNA表達(dá)質(zhì)粒沉默 RPMI8226細(xì)胞 IQGAP1后，RPMI8226-shIQGAP1(clone 1～4)組的IQGAP1蛋白較RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組表達(dá)明顯減少。同時(shí)使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組在12、24和48 h細(xì)胞增殖活性較RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組明顯下降，證實(shí)沉默骨髓瘤細(xì)胞中IQGAP1表達(dá)可影響細(xì)胞增殖。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)在外源性VEGF、IL-6和無VEGF/IL-6作用下，RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組在不同時(shí)間(12 h、24 h和48 h)活性無顯著差異，可能存在除VEGF及IL-6外的其它激活I(lǐng)QGAP1的因子。

本研究的第二部分是探討IQGAP1在骨髓瘤的發(fā)病中的作用機(jī)制，是否類似其在胰腺癌及黑色素瘤患者的機(jī)制——通過與結(jié)合RAF/MEK/ERK途徑中ERK實(shí)現(xiàn)。本文檢測(cè)RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和RPMI8226未轉(zhuǎn)染組p-ERK1/2、p-Akt和p-STAT3蛋白水平，發(fā)現(xiàn)在RPMI8226-shIQGAP1組ERK1/2磷酸化水平較其它2組下降70．2%，而3組Akt和STAT3蛋白的磷酸化水平無明顯差別。進(jìn)一步的免疫共沉淀更證實(shí)，在RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)組無ERK蛋白表達(dá)，而RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組均有IQGAP1和ERK蛋白表達(dá)，說明IQGAP1在骨髓瘤發(fā)病中的作用機(jī)制是通過結(jié)合RAF/MEK/ERK途徑中ERK實(shí)現(xiàn)的。

IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞中過表達(dá)，其機(jī)制可能通過與MAPK途徑的ERK相互作用實(shí)現(xiàn)。抑制IQGAP1可實(shí)現(xiàn)阻斷骨髓瘤內(nèi)過度活躍的RAF/MEK/ERK信號(hào)通路。IQGAP1可能成為骨髓瘤治療的全新方法及靶點(diǎn)。