馬兜鈴酸誘導大鼠腎小管上皮細胞表型轉化和膠原累積及垂盆草提取物的作用*

陸 紅， 胡麗萍， 洪 丹， 洪煒龍， 林成成， 王斯璐， 陳必成， 白永恒△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1醫學檢驗中心，3外科實驗室，浙江 溫州325000;2溫州醫科大學生命科學學院，浙江 溫州325035)

馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是服用馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)類中草藥(如馬兜鈴、天仙藤、關木通等)引起的一類特殊的腎小管間質損害，進而導致急、慢性腎功能衰竭［1］。體內AAN主要病理表現為進行性腎間質纖維化［2］，但AA如何引起間質纖維化，其機制尚不清楚，且臨床上也無確實有效的治療藥物。垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge，SSB)是一種景天科景天屬多年生草本植物，其提取物具有抑制炎性滲出和免疫調節的作用，可抵抗肝纖維化的發生發展［3］。本文從體外實驗角度，觀察SSB提取物是否具有抗AA所致的腎小管間質纖維化作用，并初步探討其可能的分子機制。

材料和方法

1 材料

1．1 試劑 馬兜鈴酸 I，購自 Sigma，純度97%，25 mg用50μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，再用DMEM細胞培養液(12．45 mL)稀釋成2 g/L原溶液;垂盆草提取物購自安徽宣城百草植物工貿公司，規格50∶1，1 g先用 DMSO 溶解(50 μL)，再用DMEM(9．95 mL)配成100 g/L原溶液;DMEM細胞培養液購自HyClone;胎牛血清購自杭州四季青生物公司;胰蛋白酶和TRIzol提取液購自Gibco;轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)ELISA檢測試劑盒購自上海西唐生物;兔抗鼠E-cadherin多克隆抗體購自Abcam;α-平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自 Santa Cruz;III型膠原多克隆抗體購自Bioworld;Dylight 488或594標記山羊抗兔IgG購自北京康位生物公司;實時熒光定量PCR試劑購自Promega。

1．2 細胞 大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1．3 儀器 MyCycler梯度 PCR儀，Bio-Rad產品;7500定量 PCR儀，Applied Biosystems產品;Varioskan Flash全波長多功能掃描儀，Thermo Scientific產品;DM4000 B LED熒光正置顯微鏡，Leica產品。

2 方法

2．1 大鼠腎小管上皮細胞的培養和處理 NRK-52E細胞置于含5%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2培養箱內培養。實驗時，將細胞按適當濃度接種于6孔板中，待細胞70% ～80%融合時，換成無血清DMEM培養液并開始正式實驗。

2．2 對照溶劑實驗 實驗中藥物AA和SSB提取物均用溶劑DMSO溶解，故先評價DMSO對細胞外基質(extracellular matrix，ECM)累積和TGF-β1的影響。AA濃度為1～100 mg/L時DMSO使用體積為0．001～0．1 mL/L體系，而SSB提取物濃度為10～2 000 mg/L時DMSO體積為0．0005～0．1 mL/L體系。因此，DMSO 損傷實驗分為 0．001、0．01 和 0．1 mL/L 3組。對照溶劑實驗結果證實在本研究使用的不同濃度范圍內DMSO對NRK-52E細胞的ECM累積和TGF-β1生成的影響并無顯著差異。

2．3 干預實驗分組 將實驗分成3組，分別為(1)溶劑對照組:不加 SSB和 AA，只加0．1μL DMSO;(2)AA損傷組:只加AA，濃度為1～100 mg/L;(3)SSB提取物干預組:在加入10 mg/L AA基礎上，同時加入SSB提取物(10～2 000 mg/L)。按照上述分組方案，加入相應藥物，置37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。

2．4 ELISA檢測促纖維化因子TGF-β1含量 取對數生長期的NRK-52E細胞，以不同濃度AA(1～10 mg/L)和SSB提取物(10～2 000 mg/L)作用24 h，收集培養液。TGF-β1含量檢測采用雙抗體夾心ABCELISA法，即用抗大鼠 TGF-β1單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的TGF-β1與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠TGF-β1，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，于450 nm處測吸光度(A)，通過繪制標準曲線求出濃度。

2．5 實時熒光定量PCR檢測E-cadherin、α-SMA、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)和I型膠原mRNA的表達 采用TRIzol試劑提取已處理細胞中的RNA，于260和280 nm測定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據試劑說明書將RNA逆轉錄成 cDNA。應用 Primer 5．0軟件設計針對 E-cadherin、α-SMA、BMP-7和I型膠原mRNA特異性引物，以β-actin作為內參照，采用相對定量法計算獲得結果。引物序列見表1，由上海捷瑞公司合成。取逆轉錄產物1μL進行PCR擴增，PCR擴增體系:5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2μL引物(上、下游各1μL，終濃度200 nmol/L)、2μL反應緩沖液和1μL cDNA。擴增程序為:95℃ 5 min;95℃ 10 s，60℃ 35 s，40個循環。以熔解曲線評價PCR結果可靠性，2－ΔΔCt法計算相對 mRNA 表達量。ΔΔCt=［Ct目的基因(待測樣品)－ Ct內參照(待測樣品)］－［Ct目的基因(校正樣品)－Ct內參照(校正樣品)］。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1．Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

2．6 細胞免疫熒光染色檢測E-cadherin、α-SMA和III型膠原蛋白的表達 將細胞經胰酶消化收集后，分別以2×105個細胞接種于含載玻片的6孔板中，常規培養。培養細胞至80% ～90%融合后，分別用AA和AA聯用SSB提取物進行處理24 h，棄去培養基，PBS清洗細胞3次，用4%多聚甲醛固定30 min，0．3%Triton X-100(1 mL/well)破膜，室溫20 min。0．5%正常山羊血清封閉。在各細胞爬片上滴加Ⅰ抗工作液，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加Dylight 488(綠色)或594(紅色)標記的Ⅱ抗工作液，37℃孵育60 min，同上洗滌。細胞胞質綠色或紅色為陽性著色。每組取3張片，每張片子取20個高倍視野(×400)，運用Image-Pro Plus 6．0軟件分析IA值。

3 統計學處理

采用SPSS 13．0軟件包分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，均數比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 倒置相差顯微鏡觀察損傷與干預前后NRK-52E細胞形態學的影響

如圖1所示，正常情況下，NRK-52E細胞培養24 h后，細胞密度極高，細胞間接觸緊密;由于接觸抑制，細胞形態小、排列成鋪路石狀。用不同濃度的AA作用后，細胞數量下降，細胞損傷表現明顯，失去貼壁作用，細胞漂浮在培養液中;細胞形態變大，出現纖維細胞樣改變(梭狀)。用SSB提取物干預后，AA所致的損傷作用大幅減輕，細胞數量下降不明顯，且細胞形態逐漸恢復正常。

Figure 1．Morphological changes of NRK-52E cells observed under inverted phase-contrast microscope(×200)．圖1 倒置相差顯微鏡觀察NRK-52E細胞的形態改變

2 SSB提取物對AA誘導的ECM累積的影響

纖維化的病理表現為大量ECM成分如I型和III型膠原在損傷局部的累積過程。我們通過細胞免疫熒光染色發現，DMSO損傷組中各濃度之間表達I型和III型膠原無明顯差異;10 mg/L AA作用NRK-52E細胞后，其表達的III型膠原明顯增多，見圖2。同樣，實時熒光定量PCR結果也顯示I型膠原mRNA的表達隨著AA濃度的增加而增高，見圖3A。在10 mg/L AA基礎上用SSB提取物進行干預，結果發現，低濃度的SSB提取物(10 mg/L)對膠原形成的影響不明顯，但中高濃度的SSB提取物(100和1 000 mg/L)能明顯降低I型膠原mRNA和III型膠原蛋白的表達水平，見圖2、3B。這些結果提示一定濃度的SSB提取物能抑制AA所致的纖維化樣效應。

Figure 2．Expression of type III collagen in NRK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment(×200)．圖2 AA對NRK-52E細胞中III型膠原蛋白表達的影響及SSB提取物的干預作用

Figure 3．The mRNA expression of type I collagen in NRK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment．Mean ±SD．n=10．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control;#P ＜0．05 vs AA(10 mg/L)．圖3 AA對NRK-52E細胞I型膠原mRNA表達的影響及SSB提取物的干預作用

3 SSB對AA誘導的腎小管上皮細胞表型轉化的影響

細胞免疫熒光染色發現，10 mg/L AA作用于NRK-52E細胞，E-cadherin蛋白表達下調，而α-SMA蛋白表達上調，見圖4。此外，實時熒光定量PCR結果同樣顯示E-cadherin mRNA表達明顯下降，α-SMA mRNA表達明顯增加，且上皮－間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)抑制分子 BMP-7 mRNA表達也下調(P＜0．05)，見圖5。這些結果提示AA誘導小管上皮細胞膠原累積過程中出現EMT效應。通過SSB提取物的干預作用，上述改變呈現相反的趨勢，見圖4、5，說明SSB提取物可抑制AA誘導的EMT進程。

Figure 4．Expression of E-cadherin andα-SMA in NRK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment(×200)．圖4 AA對NRK-52E細胞E-cadherin和α-SMA表達的影響及SSB提取物的干預作用

Figure 5．Effects of SSB extract on mRNA expression of EMT-related genes in NRK-52E cells induced by AA．Mean±SD．n=6．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control．圖5 SSB提取物對AA誘導的NRK-52E細胞EMT相關基因mRNA表達的影響

4 SSB提取物影響TGF-β1的表達水平

DMSO損傷實驗中，各組細胞間產生TGF-β1量無明顯差異。在低于10 mg/L AA作用NRK-52E細胞后，細胞分泌TGF-β1量呈現濃度依賴性，即隨著AA濃度增高，TGF-β1表達量逐漸增多，到AA濃度為10 mg/L 時達峰值［(603．4 ±30．1)ng/L］。應用SSB提取物干預10 mg/L AA后，隨著SSB提取物濃度從10 mg/L增加到2 000 mg/L，TGF-β1分泌量下降到(257．9 ±19．8)ng/L，見圖 6，提示 SSB 提取物具有抑制TGF-β1表達的作用。

Figure 6．The level of TGF-β1 in NRK-52E cells determined by ELISA．圖6 ELISA檢測NRK-52E細胞中TGF-β1水平改變

討 論

在體內，AAN主要表現為廣泛的間質纖維化，同時伴有腎小管萎縮及腎小管消失等病理改變［2］。臨床上AA引起的腎纖維化具有不可逆性，同時缺乏有效的治療藥物，病人常常以腎衰竭和尿毒癥為結局。因此，積極探索AA所致腎纖維化的分子機制，并給予有效的早期干預，對于AAN病人具有十分重要的意義。我們前期研究顯示，AA可誘導腎小管上皮細胞凋亡，并活化Sonic hedgehog信號，促使ECM成分(如I型和III型膠原)在損傷局部廣泛累積，從而導致纖維化的發生［4］。本研究中，AA促進了 α-SMA表達，抑制E-cadherin表達，并下調了BMP-7 mRNA的表達。這些結果提示腎小管上皮細胞遭受AA損傷后，形成了對損傷微環境更為耐受的肌成纖維細胞，即EMT效應。此外，研究也發現，在AA損傷腎小管上皮細胞過程中，TGF-β1的表達明顯升高。TGF-β1是目前公認的較強的促纖維化因子，同時也是EMT過程重要的調節分子。Yang等［5］研究顯示，AA損傷細胞DNA，導致細胞生長阻滯在G2/M期，進而引起JNK信號的活化，促進了TGF-β1的表達。TGF-β1的高表達不僅促進EMT進程，也促進了膠原的累積，最終引起纖維化［6］。

垂盆草又名地蜈蚣草，其化學成分有N-甲基異石榴皮堿(N-methylisopelletierine)、二氫-N-甲基異石榴皮堿、景天庚酮糖(sedoheptulose)、葡萄糖、果糖、蔗糖等。此藥性涼，味甘、淡，新鮮或干燥全草入藥，主要用于治療濕熱黃疽、小便不利、癰腫瘡瘍。有研究表明，垂盆草的提取物能抑制炎性滲出、減少肝細胞損傷、降低血清丙基酸氨基轉移酶水平，具有治療急、慢性肝炎和抗癌等功效［7-8］。然而目前尚不清楚SSB提取物能否抑制AA所致的腎小管上皮細胞損傷。本研究結果發現:濃度為100～1 000 mg/L SSB提取物能明顯降低I型和III型膠原的表達水平，提示一定濃度的SSB提取物具有潛在的抗纖維化作用。此外，我們還觀察到SSB提取物能下調α-SMA的表達，并促進E-cadherin表達。這些結果提示SSB提取物可抑制小管上皮細胞的EMT進程。同時，SSB提取物也抑制了小管上皮細胞分泌和表達TGF-β1，通過下調TGF-β1表達，進而延緩腎小管上皮細胞產生膠原的進程。

綜上所述，我們通過體外實驗初步闡明AA可促進TGF-β1表達、腎小管上皮細胞EMT進程以及膠原累積，并且AA所致的上述這些纖維化效應可被SSB提取物拮抗。因此，SSB提取物可能具有潛在的抗纖維化作用。但SSB提取物如何發揮抗腎間質纖維化作用，其確實的效應尚需體內實驗和更深入的分子機制研究加以證實和明確。